草鱼呼肠孤病毒纤维蛋白VP56 与草鱼GRP78 蛋白互作诱导内质网应激

苏 航，苏建国*

(1.华中农业大学水产学院，湖北 武汉 430070；2.青岛海洋科学与技术国家实验室，海洋生物与生物技术实验室，山东 青岛 266237)

草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国重要的淡水养殖经济鱼类，也是世界上产量最高的淡水养殖鱼类，2022 年全国草鱼产量达到590.5 万t。随着水产养殖产业的快速发展，无序养殖增加了各种水生动物疾病暴发的风险，不仅会造成巨大的经济损失，还会破坏生态环境。病原体从养殖环境至野生环境的传播也可能导致野生鱼类感染、环境污染[1]。草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)感染引起的草鱼出血病，可导致草鱼鱼种出现严重的出血症并死亡，死亡率高达90%，给我国水产养殖业造成巨大损失[2]，对草鱼养殖产业造成严重危害，同时对其他淡水经济鱼类养殖产业的健康发展也造成一定的威胁。

GCRV 是一种双链RNA (dsRNA)病毒，属于水生呼肠孤病毒属(Aquareovirus)，是水生呼肠孤病毒中毒力最强的病毒之一[3]。GCRV 病毒颗粒是一个具有双层衣壳的正二十面体，其基因组包含11 个片段，编码13 个蛋白(7 个结构蛋白和6 个非结构蛋白)[4-5]。目前，在我国已经分离鉴定出草鱼呼肠孤病毒超过30 株，其中完成全基因组测序的毒株超过12 株[6-7]。根据不同VP6 基因序列，GCRV 可 分 为GCRV-Ⅰ、GCRV-Ⅱ和GCRV-Ⅲ等3 种类型，代表毒株分别为GCRV-873 (Ⅰ型)、GCRV-HZ08 (Ⅱ型)和GCRV104 (Ⅲ型)[8]。其中，GCRV-Ⅱ是目前我国最具流行性和毒力的类型[2]，与哺乳动物正呼肠孤病毒(Orthoreovirus)同源性最高[9]。正呼肠孤病毒黏附蛋白σ1 以宿主细胞表面连接黏附分子A (JAMA)蛋白为受体进行结合，感染细胞，诱导NF-κB 活化和细胞凋亡[10]。而对于GCRV，感染宿主细胞的机制尚未阐明。由GCRV-Ⅱ的s7 片段编码的VP56蛋白，分子量约为56 ku，是GCRV-Ⅱ/Ⅲ特有的纤维蛋白，可能在GCRV 感染过程中发挥黏附于宿主细胞表面的作用，在病毒入侵宿主环节起重要作用[11-12]。

内质网(ER)是负责胞内蛋白质和脂质合成、外源物质解毒和胞内钙离子稳态的重要细胞器[13]。内质网稳态一旦遭到破坏，细胞内未折叠或错误折叠的蛋白质就会在内质网内腔中累积，激活内质网应激状态，发生未折叠蛋白质反应(UPR)。葡萄糖调节蛋白78(GRP78)是一种常驻内质网的分子伴侣，在内质网应激状态下，UPR 反应激活从内质网到细胞核的级联信号转导，GRP78 表达增强[14]。内质网应激状态下，GRP78 与未折叠蛋白结合，导致从PERK-eIF2α 途径、IRE1α-XBP1途径和活化转录因子6 (ATF6)途径的内质网跨膜转化子解离[15]。3 个途径通过对基因的转录调控，维持应激期间内质网的稳态[16]。在哺乳动物中，内质网应激参与抗病毒反应，然而在鱼类中，涉及内质网相关的抗病毒反应研究较为有限[17-18]。

GCRV 与细胞表面蛋白的相互作用具有细胞类型特异性和趋向性，是病毒诱导细胞内信号转导的决定因素。为了探究GCRV 感染机制，减少草鱼出血病暴发带来的巨大经济损失，前期通过内源性co-IP、蛋白质体外结合实验(GST pull down)结合液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)鉴定，发现GCRV-Ⅱ的VP56 可能与GRP78 互作[19]。本研究通过经典正向和反向co-IP 和双分子荧光互作技术证实了VP56 与GRP78 互作，通过透射电镜发现VP56 使内质网形态发生改变，激活内质网应激，通过ATF6 介导的信号通路激活非折叠蛋白反应。实验探究GCRV 病毒与宿主蛋白的相互作用及效应，为研究GCRV 的致病机理提供了新思路，有助于草鱼抗病毒免疫研究的发展和草鱼养殖中出血病的防控。

1 材料与方法

1.1 细胞和病毒

实验用细胞系包括草鱼肾细胞系(C.idellakidney cells,CIK cells)，购于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，经本实验室传代扩大培养并保存；胖头鲤细胞系(fathead minnow,FHM)保存于本实验室。CIK 和FHM 细胞系分别培养于DMEM 和M199 培养基[包含10% FBS (Gibco，美国)、100 U/L 青霉素(Sigma,美国)、100 μg/mL 链霉素]，28oC 二氧化碳(5%)培养箱中培养；VP56 或空载稳定表达的CIK 细胞系使用G418 筛选。实验用病毒毒株为GCRV-097 株(GCRV-Ⅱ)，由中国科学院水生生物研究所汪亚平研究员惠赠，后经本实验室保种富集。

1.2 载体构建

实验利用pCMV-eGFP 载体构建重组质粒pCMV-VP56、pCMV-VP56-Flag 及pCMV-GRP78-HA 等；双分子荧光互补载体pMN155 和pMC156由中国科学院武汉病毒研究所崔宗强研究员惠赠。载体构建所用引物信息见表1。

表1 载体构建及实时荧光定量PCR (RT-qPCR)引物信息Tab.1 The primers and their designated applications in vector construction and RT-qPCR

1.3 细胞转染

将状态良好的细胞传代至10 cm 细胞培养皿(6×106～8×106个/皿)中，培养24 h，使细胞刚好均匀长满整个培养基，使用转染试剂FuGENE®6(Promega,美国)进行转染，每个培养皿转染4 μg对应质粒；将培养皿放入CO2培养箱中培养。48 h 后观察细胞状态并收集细胞进行下一步实验。

1.4 免疫共沉淀

常温收集FHM 细胞，加入终浓度为1 mmol/L 的PMSF 的IP 裂解缓冲液[20 mmol/L Tris(pH 7.4)，150 mmol/L NaCl，1% Triton X-100，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L Na3VO4，0.5 μg/mL 亮抑肽酶，2.5 mmol/L 焦磷酸钠] 1 mL 于冰上裂解细胞30 min。裂解后取80 μL 上清液，加入20 μL 的5 × SDS 上样缓冲液，制备全细胞裂解液(WCL)备用。剩余IP 样品加入1 μL 的IP 级一抗，置于摇床4 °C 摇晃孵育过夜。吸取40 μL/个样品的protein A+G 琼脂糖磁珠，清洗并加入IP 样品，4°C 摇晃孵育6 h。离心取沉淀，使用IP 裂解缓冲液洗涤3～4 次后加入2 × SDS-PAGE上样缓冲液煮样，免疫印迹(immunoblotting,IB)检测IP 结果或直接将样品保存于-80°C 备用。

1.5 免疫印迹

取细胞蛋白样品分别进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，半干转膜法转移至NC 膜上，于2%的BSA 封闭液中室温封闭2 h；将标签抗体稀释至适当浓度，4 °C 孵育过夜；选择与一抗对应种属的HRP 标记的二抗，室温孵育1 h；每次反应后均用TBST 洗3～5 次，每次10 min。用TMB 显色剂显色并观察结果。

1.6 基于远红外红色mNeptune 的双分子荧光互补系统(BiFC)

基于mNeptune 的BiFC 系统可视化检测CIK细胞中VP56 和GRP78 之间的相互作用。重组质粒pGRP78-MN155 和pMC156-VP56 分别在GRP78的C 末端包含mNeptune 蛋白的N 末端(mNeptune amino acid 1-155,MN155)，在VP56 的N 末端包含mNeptune 蛋白的C 末端(mNeptune amino acid 156-244,MC156)，末端编码区之间分别通过接头序列GGGGSGGGGS 连接。质粒pGRP78-MN155和pMC156-VP56 分别或共同转染入CIK 细胞中，培养后使用激光共聚焦显微镜观察mNeptune 蛋白是否发光。红色荧光显示2 种蛋白在空间构象上相互作用，使mNeptune 蛋白的2 个末端相互结合，使mNeptune 蛋白在激发后发光。红色荧光的检测波段为640/20 nm (激发光)和685/40 nm (发射光)。

图版Ⅰ BiFC 检测VP56 与GRP78 互作CIK 细胞共转染或单独转染pGRP78-MN155 和/或pMC156-VP56 质粒48 h，DAPI 染核后，根据BiFC 系统，使用激光共聚焦显微镜观察、拍照；红色荧光代表蛋白互作阳性。Plate Ⅰ Interaction between VP56 and GRP78 detected by BiFCpGRP78-MN155 and pMC156-VP56 were transfected alone or co-transfected into CIK cells under normal conditions;in the BiFC system,the nucleus was stained with DAPI,and the images were acquired using confocal microscopy under a 40 × objective lens;appearance of red fluorescence represents positive interaction.

1.7 激光共聚焦显微镜观察

将过表达相应BiFC 载体的CIK 细胞接种至细胞培养板中，于CO2培养箱中培养48 h。细胞经磷酸钠缓冲溶液(PBS)清洗3 次，使用600 μL新鲜配制的4%的多聚甲醛溶液固定细胞，室温孵育10 min。固定后的细胞用PBS 清洗3 次，加入DAPI 染液避光孵育3～5 min。用新鲜PBS 小心洗涤细胞3 次后在激光共聚焦显微镜(SP8,Leica)下观察并拍照。

1.8 透射电子显微镜(TEM)观察

将相应的稳转细胞传代至6 孔细胞培养板，48 h 后用PBS 洗3 次，胰酶消化，收集细胞，用1 mL 电镜固定液(2.5%戊二醛)轻缓吹散细胞，室温放置48 h，离心弃上清液，加1 mL 新的固定液(不能吹散细胞)。固定后的细胞样品制片后使用透射电子显微镜(Hitachi,日本)观察并拍照。

1.9 RT-qPCR

取稳转VP56 或空载的CIK 细胞样品，根据NCBI GenBank 基因序列，使用Primer Premier 5软件设计定量引物(表1)，以EF1α作为内参基因进 行RT-qPCR。反 应体系为15 μL：7.5 μL 2×SYBR Green BioEasy Master Mix，2 μL cDNA，5.1 μL灭菌超纯水，上下游引物各0.2 μL；反应程序：95 °C 预变性1 min；94 °C 变性15 s，60 °C 退火15 s，72 °C 延伸20 s，共40 个循环。

1.10 数据分析

用GraphPad Prism 8 软件对实验数据进行分析、统计和作图。每组实验数据均由3 次及以上独立重复数据组成。使用Student’st检验分析实验数据的差异显著性，并进行统计学分析。数据以平均值±标准差表示。

2 结果

2.1 VP56 与GRP78 互作

通过经典正向和反向co-IP 发现VP56 与GRP78 发生相互作用。首先通过GRP78 蛋白融合的HA 标签，使用特异性抗体进行co-IP，以过表达空载质粒和IgG 为对照，结果显示为可检测到阳性VP56 条带(图1-a)，说明VP56 和GRP78 蛋白相互作用。通过VP56 蛋白融合的Flag 标签，以过表达空载质粒和IgG 为对照，使用Flag 特异性抗体进行co-IP 的结果显示出了GRP78 蛋白阳性条带(图1-b)。2 个co-IP 结果均表明VP56 与GRP78 之间存在相互作用。

图1 co-IP 检测VP56 与GRP78 互作(a) FHM 细胞共转染VP56-GFP/空载质粒和GRP78-HA，48 h 后使用HA 标签抗体或小鼠IgG (对照)进行co-IP，然后使用相应抗体进行IB鉴定，(b) FHM 细胞共转染GRP78-HA/空载质粒和VP56-Flag，48 h 后使用Flag 标签抗体或小鼠IgG (对照)进行co-IP，然后使用相应抗体进行IB 鉴定；1.IP: HA，2.IP: IgG，3.IP: HA，vector.pCMV-GFP。Fig.1 Interaction between VP56 and GRP78 by co-IP(a) FHM cells were co-transfected with VP56-GFP/vector and GRP78-HA for 48 h,co-IP was performed with anti-HA monoclonal Ab and mouse IgG(control),and IB with the respective Abs,(b) FHM cells were co-transfected with GRP78-HA/vector and VP56-Flag for 48 h.co-IP was performed with anti-Flag monoclonal Ab and mouse IgG (control) and IB with the respective Abs;1.IP: HA,2.IP: IgG,3.IP: HA,vector.pCMV-GFP.

BiFC 实验进一步验证了VP56 和GRP78 之间的相互作用。mNeptune 蛋白是一种红色荧光蛋白，将其N 端(MN155)和C 端(MC156)分别构建于GRP78 和VP56 蛋白分子的C 端和N 端。在分别共表达单端融合蛋白和mNeptune 蛋白另一端时，在激光共聚焦显微镜下不能观察到红色荧光。将分别融合了MN155 和MC156 的GRP78 和VP56蛋白同时表达，通过激光共聚焦显微镜，在远红外波段可观察到mNeptune 蛋白发出红色荧光(图版Ⅰ)。结果显示，VP56 和GRP78 蛋白表达后，在细胞内结合，mNeptune 蛋白的两端靠近发出红色荧光，表明VP56 和GRP78 相互作用。

2.2 VP56 导致内质网形态变化

GRP78 是锚定于内质网的分子伴侣。使用电子透射显微镜观察稳定表达VP56 的CIK 细胞时，与稳定表达空载质粒的CIK 细胞相比，细胞内质网发生了形态变化，出现肿胀、扩张和脱粒等现象(图版Ⅱ)，说明VP56 引起了内质网形态的变化，激活内质网应激。

2.3 VP56 通过ATF6 激活内质网应激

为探究VP56 激活内质网应激下游非折叠蛋白反应的途径，利用相关引物(表1)，通过RTqPCR 检测内质网应激下游非折叠蛋白反应3 条不同途径关键分子的mRNA 表达水平(图2)。结果显示，VP56 显著诱导atf6 表达，对另外2 条途径关键分子无显著影响，表明VP56激活内质网应激，诱导ATF6 信号传导途径，造成非折叠蛋白反应。

图2 VP56 通过ATF6 诱导UPR1.grp78，2.atf4，3.atf6，4.traf2；*.P＜0.05,**.P＜0.01；转录表达水平以EF1α 基因表达水平为标准，以对照组为1。Fig.2 VP56 activates UPR through ATF61.grp78,2.atf4,3.atf6,4.traf2;*.P＜0.05,**.P＜0.01;the relative transcription levels were normalized to the transcription level of EF1α gene and are represented as fold induction relative to the transcription level in control cells,which was set to 1.

3 讨论

图版 Ⅱ VP56 过表达影响内质网形态变化1.对照，2.VP56，N.细胞核，E.内质网 (白色箭头)。Plate Ⅱ Effect of VP56 overexpression on ER morphology1.control,2.VP56,N.nucleus,E.endoplasmic reticulum (white arrows indicate).

草鱼出血病严重危害我国草鱼养殖产业，不仅造成巨大的经济损失，还严重威胁着我国水产养殖产业的健康可持续发展。病毒性疾病在水环境中传播性很强。传染性疾病发生的基本条件包括宿主、病原体和环境。为了控制疾病的传播，从病原体出发，对病毒蛋白的分子功能，及其与宿主关系的阐释，有利于病毒性疾病的控制。因此，在草鱼出血病防控及GCRV 感染机制研究中，病毒蛋白的功能亟待研究。GCRV 目前分成3 个基因型，对于GRCV-I 研究的较为深入，而对流行基因型GCRV-II 的研究相对较少。本实验从GCRV-II 纤维蛋白VP56 与宿主蛋白互作方面着手，发现VP56 与内质网标识蛋白GRP78 互作，激活内质网应激。

病毒感染过程中，病毒一般通过吞噬作用、巨胞饮、网格蛋白、包膜窖依赖的内吞作用以及其他不依赖于网格蛋白和包膜窖的内吞途径进入宿主细胞，而GCRV 进入细胞的途径有可能与网格蛋白与窖蛋白介导的内吞作用有关[20-21]。感染哺乳动物的正呼肠孤病毒利用宿主细胞表面的JAMA 为受体，通过黏附蛋白σ1 与其结合，从而进入细胞[22-23]。在水生呼肠孤病毒中，已知多种有可能与病毒蛋白互作的分子，如Fibulin-4、Ubc9、LITAF、LamR 和TIA1 等[24-28]。根据同源比对分析，VP56 与正呼肠孤病毒的黏附蛋白σ1同源性很高，极有可能行使黏附功能。在GCRV感染宿主细胞过程中，嵌于GCRV 病毒颗粒表面的纤维蛋白VP56 黏附并固定与于宿主细胞表面，进而完成后续进入细胞的生物过程[11]。

利用co-IP 和BiFC 实验证实了VP56 与GRP78之间的相互作用。使用传统的研究蛋白分子互作的方法co-IP，根据抗原-抗体结合原理，并且辅以空载质粒对照和免疫球蛋白抗体对照，使用融合在2 个蛋白分子上的不同标签抗体进行co-IP，使本研究中发现的VP56 和GRP78 的互作结果更加可靠。同时使用新兴的研究分子间互作的基于远红外红色mNeptune 蛋白的双分子荧光互补系统[19,29]，通过激光共聚焦显微镜，直观地观察到VP56 和GRP78 蛋白分子在CIK 细胞中的结合，进一步证实了两个分子间的相互作用。

本研究发现VP56 与GRP78 相互作用。分别检测3 个UPR 分支的关键分子后，VP56 激活了ATF6 途径中的关键转录因子ATF6，而未激活另外2 个分支中的关键转录因子ATF4 和TRAF2，表明了VP56 与GRP78 结合触发ATF6 途径，即VP56 引起的内质网应激和UPR，表明GCRV-Ⅱ感染导致细胞内稳态破坏。VP56 破坏胞内稳态，引起ER 应激和UPR 反应，对内质网的形态造成巨大损伤，影响其功能。GCRV 攻击宿主时，破坏宿主细胞稳态，内质网应激参与胞内抗病毒反应，VP56 对内质网的损伤有利于GCRV 病毒逃逸。

综上所述，本研究通过co-IP 和BiFC 实验证实了GCRV-Ⅱ纤维蛋白VP56 和内质网分子伴侣GRP78 的相互作用，进而发现VP56 可引起内质网的形态变化，激活内质网应激，诱导ATF6 介导的非折叠蛋白反应。研究表明，GCRV 感染过程中，VP56 激活内质网应激，打破细胞稳态。本研究从病毒与宿主蛋白互作的角度阐释了VP56在GCRV 感染过程中的功能，为GCRV 感染机制的研究提供新思路。

（作者声明本文无实际或潜在的利益冲突）