Akt 在中华绒螯蟹免疫中的功能

许青松，李 兵，杨冰慧，马金龙，洋 雯，曲 琛

(1.大连民族大学生命科学学院，生物技术与资源利用教育部重点实验室，辽宁 大连 116600；2.大连海洋大学水产与生命学院，辽宁 大连 116023)

Akt 又称为蛋白激酶B (PKB)，是一种丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)蛋白激酶，在人类和小鼠中发现Akt 有3 种异构体(Akt1、Akt2 和Akt3)，它们均具有高度保守的氨基酸末端pleckstrin 同源(PH)结构域、中央激酶结构域及包含疏水基序的羧基末端调节域，作为PI3K-AKT 信号通路的核心分子，Akt 可以激活下游多种转录因子，在细胞增殖、代谢、发育和存活等过程中发挥着重要作用[1]。Akt 分子的功能在癌症发展、神经退行性疾病、中风和糖尿病中被普遍研究，甚至作为一些药物潜在靶点被应用于治疗过程中[2]。

Akt 分子结构和功能在水产动物领域中的研究相对滞后，大多停留在基因的序列特征、进化特点、基因克隆表达和初步功能分析[3]。谌爽等[4]在斑马鱼(Danio rerio)中成功克隆获得了Akt基因(Akt3)，分析了其序列同源性、进化特性，以及在斑马鱼早期胚胎发育中的功能，发现注射Akt 后斑马鱼胚胎脑部厚度比对照组显著增加，表明Akt 对斑马鱼胚胎脑部尺寸发育有影响。王金凤等[5]在斑马鱼、草鱼(Ctenopharyngodon idella)和尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)中研究了低温胁迫对鱼类PI3K/AKT/GSK-3β 信号通路的影响，发现低温激活了PI3K/AKT/GSK-3β 信号通路，不同低温耐受能力的鱼对信号通路的响应呈现出不同的情况。Wang 等[6]在香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)中克隆获得了Akt基因(ChAkt1)，其广泛表达于牡蛎胚胎形成和幼虫发育的不同组织中，ChAkt1 在牡蛎应对各种刺激、微生物病原体和高温胁迫中发挥着重要作用。刘丽等[7]在仿刺参(Apostichopus japonicus)中成功克隆获得了Akt基因(AjAkt)，并对该基因的序列特征、组织表达规律以及对灿烂弧菌(Vibrio splendidus)刺激的响应规律进行了研究，发现AjAkt基因在仿刺参机体调控细菌入侵的免疫防御中发挥重要作用。Zhou 等[8]在罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)中成功克隆获得了Akt基因(MrAkt)，发现该基因在氨基氮或亚硝酸盐急性应激过程中高表达，为PI3K-AKT 途径参与对虾应对亚硝酸盐和氨胁迫的免疫毒理反应提供了证据。田志环等[9]在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)中克隆获得Akt基因(EsAkt)的cDNA 序列，主要研究了EsAkt基因对中华绒螯蟹蜕壳前后肌肉生长的影响，发现EsAkt在蟹蜕壳过程中不同部位肌肉组织中的表达量差异与蜕壳周期关系密切，说明EsAkt参与中华绒螯蟹蜕壳引起的肌肉萎缩、生长及重建的生理过程。然而Akt基因在中华绒螯蟹免疫过程中如何发挥作用却未见报道，本研究利用分子手段克隆获得了中华绒螯蟹Akt基因，研究其在不同的免疫器官和组织中的表达和细胞内定位，以及对脂多糖和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的免疫响应情况，为深入探究中华绒螯蟹免疫防御机制提供新的借鉴。

1 材料与方法

1.1 实验材料

中华绒螯蟹购自江苏连云港中华绒螯蟹养殖场，在18～20 °C 的淡水中暂养，每天定时换水并投喂适当的饵料，暂养7 d 后用于实验。6 周龄雌性昆明小鼠购于大连医科大学，暂养7 d 后用于多克隆抗体的制备。嗜水气单胞菌由大连海洋大学叶仕根博士提供，脂多糖(LPS)和大肠杆菌(Escherichia coli) 0111:B4 购自Sigma Aldrich 公司。

1.2 样品采集

中华绒螯蟹[(80±5) g]，使用一次性无菌注射器从第三步足基部插入采集血淋巴，并按体积比1∶1 与抗凝剂(氯化钠510 mmol/L、柠檬酸200 mmol/L、葡萄糖100 mmol/L、柠檬酸三钠30 mmol/L，pH 7.3)混匀，800×g，4 °C，离心10 min，收集血淋巴细胞。然后在冰上取蟹的肝胰腺、心脏、胃、鳃、肌肉、肠道等组织，液氮速冻，-80 °C保存备用。实验过程中操作人员严格遵守国家和相关部门伦理规范，并按照“大连民族大学生物与医学伦理委员会”制定的规章制度执行。

1.3 免疫刺激实验

本研究以LPS 和嗜水气单胞菌为免疫刺激物进行免疫刺激实验[10]。用PBS 溶液稀释LPS，终浓度为100 μg/mL，用PBS 重悬嗜水气单胞菌至1×107CFU/mL，随机挑选暂养的健康中华绒螯蟹[(20±2) g] 108 只，平均分为3 组(PBS 组、LPS 组和嗜水气单胞菌组)，分别向各组中华绒螯蟹注射100 μL PBS、100 μL LPS 和100 μL 嗜水气单胞菌溶液，注射0、3、6、12、24 和48 h 后，每个时间点随机挑选6 只中华绒螯蟹，收集血淋巴细胞。

1.4 RNA 提取、cDNA 合成及实时荧光定量PCR

参考Yu 等[11]RNA 提取、cDNA 合成及实时荧光定量PCR (qRT-PCR)的方法，利用Trizol 试剂(Invitrogen，美国)进行中华绒螯蟹血淋巴细胞总RNA 的提取，然后用分光光度计Nanodrop 2000 (Thermo Scientific，美国)对提取出的RNA进行定量分析，取2 μL RNA 用于琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的完整性。按照试剂盒PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa，日本)的说明书要求进行cDNA 的反向合成。以获得的cDNA 为模板，使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒(TaKaRa，日本)，按说明书要求设置PCR 反应体系和程序，结合表1 中基因类别和引物序列，以中华绒螯蟹的β-actin基因作为内参基因，利用ABI-Q6-Flex 实时荧光定量PCR 仪进行扩增，结果按照2-ΔΔCt方法进行计算。

表1 研究中采用的引物序列Tab.1 Primers used in this study

1.5 原核表达、蛋白纯化及多克隆抗体制备

分析目的基因和表达载体的序列组成特点，选择合适的酶切位点，设计特异性的5'端带有酶切位点的引物(表1)，将酶切后的目的片段和表达载体进行连接，连接产物转化到克隆感受态Trans 5α 中，对测序正确的菌株进行扩增培养及质粒提取，再将提取的重组质粒转化到表达菌株BL21(DE3)，使用12% 的SDS-PAGE 进行电泳，并利用考马斯染色法验证重组蛋白的表达。将pGEX4T-1(Novagen)作为重组表达的载体，pGEX4T-1 重组质粒经诱导后，蛋白带有一段具有谷胱甘肽S-转移酶蛋白标签(GST-Tag)的序列。获得重组蛋白后进行尿素浓度梯度透析复性，使用获得的复性蛋白对6 周龄雌性小鼠进行4 次免疫，制备多克隆抗体，眼球摘除法将小鼠血样收集到1.5 mL 离心管中，离心收集上层血清作为制备的多克隆抗体，利用Western blot 法检测制备的中华绒螯蟹Akt 多克隆抗体的效果[12]。

1.6 细胞免疫荧光检测

利用无菌注射器抽取中华绒螯蟹血淋巴细胞，4%多聚甲醛重悬血淋巴细胞，固定10 min。混匀后滴加到多聚赖氨酸包被的载玻片上，室温静置2 h，使细胞紧贴载玻片。采用0.5% Triton X-10对细胞进行透化处理10 min，3%胎牛血清蛋白(BSA)封闭1 h，再用3% BSA 稀释液对制备的Akt 多克隆抗体进行稀释(1∶500，体积比)，室外孵育1 h，洗涤后用BSA 稀释带有Alexa Fluer 488 标签的抗体(1∶1 000，体积比)，避光孵育1 h，再用3% BSA 稀释DAPI，在样品上滴加50 μL 稀释液对细胞核进行染色，室温静置10 min，避光。洗涤后用20 μL 50%甘油进行封闭，盖片，荧光显微镜下观察拍照。

1.7 RNA 干扰

用siRNA 位点预测软件对EsAkt 进行分析，选择包含siRNA 位点较多的区间片段进行干扰引物设计(表1)。合成对应的干扰片段，以中华绒螯蟹血淋巴细胞的cDNA 作为模板，将扩增产物进行回收、纯化，用作双链RNA(dsRNA)的合成模板。此外，还需要合成绿色荧光蛋白(EGFP)的dsRNA作为对照。dsRNA 的合成使用in vitroTranscription T7 试剂盒(TaKaRa)。dsRNA 准备好后，挑选36 只暂养7 d 的中华绒螯蟹并随机分为3 组(正常组、dsEGFP 组及dsEsAkt 组)，每组12 只。正常组、dsEGFP 组及Akt 干扰组分别注射100 μL PBS、100 μL EGFP 和 100 μL Akt 的 dsRNA，dsRNA 的终浓度都为1 μg/μL。并按照上述方法分别在注射后0 和24 h 进行血淋巴细胞收集，用于RNA 提取和qRT-PCR 分析。

1.8 数据分析

实验数据用SPSS 20 软件进行统计分析，利用单因素方差分析方法(ANOVA)对不同处理组差异进行比较。P＜0.05 代表差异显著，P＜0.01 代表差异极显著。

2 结果

2.1 中华绒螯蟹Akt 基因序列分析

从NCBI 和中华绒螯蟹基因组(PRJNA305216)获得了中华绒螯蟹Akt的序列信息，并利用特异性引物及PCR 技术克隆得到了相关序列(命名为EsAkt)。利用生物信息学技术分析，EsAkt的cDNA全长2 200 bp，其中开放阅读框(ORF)为1 545 bp，编码514 个氨基酸。通过SMART 结构域分析表明，EsAkt 分子包含3 个保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域：PH 结构域、中心催化结构域(S_TKc)和羧基端疏水结构域(S_TK_X) (图1)。

图1 EsAkt 核酸序列、氨基酸序列和结构域分析(a) EsAkt 核酸序列和氨基酸序列，*表示为终止密码子(TGA)；(b) EsAkt 结构域。Fig.1 Nucleotide,deduced amino acid sequence and protein domain of EsAkt(a) nucleotide and deduced amino acid sequence of EsAkt，* represents the stop codon (TGA),(b) protein domain of EsAkt.

2.2 中华绒螯蟹Akt 基因组织分布

利用qRT-PCR 技术分析EsAkt基因mRNA 在各组织(肠、胃、心脏、血淋巴细胞、鳃、肝胰腺和肌肉)中的表达水平。结果表明，EsAkt的mRNA 在所有被检测的组织中呈现组成型表达，在免疫相关组织(如肝胰腺、鳃和血淋巴细胞)中的表达量相对较高。EsAkt在肌肉、肝胰腺、鳃、血淋巴细胞、心脏和胃中的表达分别为肠表达水平的18.11±1.29 倍(P＜0.05)、11.45±1.61 倍(P＜0.05)、5.48±0.41 倍 (P＜0.05)、2.47±0.44 倍 (P＜0.05)、2.40±0.19 倍(P＜0.05)和1.08±0.09 倍(P＞0.05) (图2)。

图2 EsAkt mRNA 在各组织中的相对表达量1.肠，2.胃，3.心脏，4.血淋巴细胞，5.鳃，6.肝胰腺，7.肌肉。柱形图上不同的字母代表组间存在显着差异(P＜0.05)。Fig.2 Relative mRNA expression of EsAkt in different tissues1.intestine,2.stomach,3.heart,4.hemocytes,5.gills,6.hepatopancreas,7.muscle.Different letters indicate that there were significant differences between groups (P＜0.05).

2.3 EsAkt 多克隆抗体制备及细胞定位

重组EsAkt 质粒在表达菌株BL21 (DE3)中利用IPTG 进行诱导表达，然后用GST 柱进行重组蛋白纯化。结果显示，纯化后的rEsAkt 条带单一，蛋白分子量约为86 ku (图3-a)。将纯化得到的rEsAkt 进行多克隆抗体的制备，利用Western blot检验抗体的特异性，EsAkt 的多克隆抗体可以识别rEsAkt (图3-b)。利用免疫荧光技术检测EsAkt蛋白在血淋巴细胞中的细胞定位情况，绿色代表EsAkt 蛋白的分布，蓝色代表DAPI 标示的细胞核，EsAkt 蛋白主要以弥散状的形式分布在血淋巴细胞的细胞质中(图4)。

图3 EsAkt 重组蛋白的SDS-PAGE 及Western blot 分析(a) M.蛋白标准，1.EsAkt 对照菌液(未加IPTG)，2.EsAkt 诱导菌液(IPTG 诱导)，3.纯化EsAkt 重组蛋白；(b) 1.Western blot 检验EsAkt 多克隆抗体。Fig.3 SDS-PAGE and Western blot analysis of EsAkt(a) M.standard protein molecular weight marker,1.negative control for rEsAkt (without IPTG induction),2.IPTG induced rEsAkt,3.purified rEsAkt protein;(b) 1.Western blot analysis of rEsAkt with prepared anti-EsAkt antibody.

图4 EsAkt 在血淋巴细胞中的定位(a) 明场下的细胞形态，(b) EsAkt 的阳性信号呈现绿色，(c) DAPI对细胞核染色呈现蓝色，(d) 叠加图确定EsAkt 的分布。Fig.4 Subcellular localization of EsAkt in hemocytes(a) morphology of hemocytes were shown in bright field,(b) positive signals of EsAkt were shown in green,(c) nucleus stained by DAPI were shown in blue,(d) merge map to determine the distribution of EsAkt.

2.4 免疫刺激后血淋巴细胞中EsAkt 的表达

本研究利用LPS 和嗜水气单胞菌对中华绒螯蟹进行免疫刺激，LPS 刺激3 和6 h 后，EsAkt的mRNA 表达量开始升高，分别为PBS 组的1.59±0.30 倍(P＜0.05)和2.81±0.15 倍(P＜0.01)。刺激12和24 h 后，EsAkt的mRNA 表达量继续上升，分别为对照组3.95±0.30 倍和4.35±0.22 倍(P＜0.01)。刺激48 h 后，EsAkt的mRNA 表达量有所降低，但仍是PBS 组的2.62±0.29 倍(P＜0.01) (图5)。嗜水气单胞菌分别刺激3 和6 h 后，EsAkt的mRNA表达量逐渐升高，分别为PBS 组的3.52±0.29 倍和9.05±0.99 倍(P＜0.01)。刺激12 和24 h 后，EsAkt的mRNA 表达量下降，分别为PBS 组的6.62±3.34倍和3.46±0.53 倍(P＜0.01)。刺激48 h 后，EsAkt的mRNA 表达量恢复正常(1.40±0.21 倍，P＞0.05)。

图5 免疫刺激后血淋巴细胞EsAkt mRNA 的表达模式(a) 脂多糖刺激后EsAkt 在血淋巴细胞中的表达情况，(b) 嗜水气单胞菌刺激后EsAkt 在血淋巴细胞中的表达情况，PBS 为对照组。“*”代表P＜0.05，“**”代表P＜0.01，为组间差异。Fig.5 Temporal mRNA expression of EsAkt after immune challenges in hemocytes(a) temporal expression of EsAkt after LPS stimulation,(b) temporal expression of EsAkt after A.hydrophila stimulation;PBS was used as control.One asterisk indicates significant difference at P＜0.05,and two asterisks indicate extremely significant difference at P＜0.01;the differences are between groups.

2.5 EsAkt 干扰后凋亡相关基因的表达

利用dsRNA 对EsAkt基因进行干扰，结果显示，dsRNA 注射24 h 后，干扰组EsAkt的mRNA表达量显著低于正常组(0.38±0.21 倍，P＜0.05)，正常组和dsEGFP 组中EsAkt的mRNA 表达量无显著差异(P＞0.05) (图6-a)。此外，为探究EsAkt是否参与调节凋亡相关基因表达，在EsAkt干扰后检测凋亡相关基因EsCaspase-3-like的表达情况，发现EsAkt 干扰组的EsCaspase-3-like表达量显著上调，为正常组的2.69±0.92 倍(P＜0.05) (图6-b)。

图6 EsAkt 干扰及凋亡相关基因的表达(a) EsAkt 在血淋巴细胞中的干扰效率，(b) 抑制EsAkt 后EsCaspase-3-like 的表达情况。1.正常组，2.dsEGFP 组，3.dsEsAkt 组。“*”代表P＜0.05。Fig.6 Inhibition of EsAkt and expression of apoptosis related gene(a) efficiency of EsAkt inhibition,(b) mRNA expression level of EsCaspase-3-like after the inhibition of EsAkt.1.normal group,2.dsEGFP group,3.dsEsAkt group."*" indicates significant difference at P＜0.05.

3 讨论

面对日益严峻的养殖环境，中华绒螯蟹病害防御基础理论研究却很薄弱，丰富中华绒螯蟹免疫防御基础理论知识，寻找安全有效的病害防控方法成为中华绒螯蟹养殖产业中亟待解决的问题，本研究针对这一问题，主要探索Akt 在中华绒螯蟹免疫防御中的功能和作用机制。本研究利用生物信息学技术，克隆获得EsAkt的cDNA 全长，结果与田志环等[9]报道的中华绒螯蟹Akt序列一致。EsAkt 分子包含PH 结构域、中心催化结构域(S_TKc)和羧基端疏水结构域(S_TK_X) 3 个保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域，符合典型的Akt 结构域特征[13]。EsAkt的mRNA 在所有被检测的组织中呈现组成型表达，这与之前在斑马鱼[4]、香港牡蛎[6]、仿刺参[7]和罗氏沼虾[8]中报道的情况类似，说明Akt在各组织中广谱表达，提示可能参与多种生命活动。在甲壳动物中，肝胰腺、鳃和血淋巴细胞是其免疫过程的关键环节和重要参与者，这些免疫器官或组织在受到外界刺激后能快速做出响应，分泌凝集素、抗菌肽和溶菌酶等免疫分子，有效清除入侵的病原体[14]。本研究中发现，EsAkt在免疫相关组织(如肝胰腺、鳃、血淋巴细胞)中的表达量相对较高，预示Akt 可能参与中华绒螯蟹的免疫防御反应。此外，基于EsAkt 蛋白的细胞定位研究表明，EsAkt 蛋白主要是以弥散状的形式分布在血淋巴细胞的细胞质中。这与已报道的人和小鼠的Akt 分布情况一致[15]，活化的Akt 可以磷酸化多种酶、激酶和转录因子等下游分子，发挥调节细胞功能的作用。EsAkt的细胞定位进一步证明其具有保守的功能，可能在细胞免疫和维持稳态的过程中发挥重要作用。

PI3K-AKT 信号在细胞增殖、细胞代谢调控、细胞发育及存活等多种细胞过程中发挥重要作用，同时也参与宿主抵抗外源刺激物引起的免疫过程。Tang 等[16]在克氏原螯虾(Procambarus clarkii)中对铜离子应激引起的免疫反应进行研究，发现PI3K-AKT 信号通路参与其中，免疫相关基因被上调表达，提示重金属铜可以引起克氏原螯虾氧化应激和免疫反应。Kong 等[17]对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)由溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)引起的免疫反应进行研究，发现PI3K-AKT信号通路被激活，从而增加抗菌肽(LvPEN4)的表达，提高机体对溶藻弧菌的抵抗力。Ruan 等[18]克隆了凡纳滨对虾Akt基因(LvAkt)，发现在白斑综合征病毒(WSSV)感染对虾的早期阶段，LvAkt表达上调，而PI3K 特异性抑制剂可以降低病毒基因转录水平，提示PI3K-AKT 信号可能在凡纳滨对虾对抗WSSV 的免疫应答中起重要作用。细菌性病害是中华绒螯蟹养殖过程中的主要致病因素之一，LPS 是构成革兰氏阴性菌细胞壁的重要成分，可以用于模拟革兰氏阴性菌的攻击，而嗜水气单胞菌属于革兰氏阴性菌，是中华绒螯蟹养殖过程中的主要致病菌之一[19]。本研究中LPS 刺激后3～24 h，EsAkt的mRNA 表达量逐渐升高，在刺激后48 h 才开始下降，嗜水气单胞菌刺激6 h 后，EsAkt的mRNA 表达水平达到最高，随后逐渐降低，并在48 h 恢复到正常水平，中华绒螯蟹对嗜水气单胞菌的响应速率比LPS 更快，强度更高。EsAkt免疫应激变化趋势与香港牡蛎ChAkt1 响应溶藻弧菌和酵母菌变化趋势相近，都是先升高，后降低的过程[6]。

甲壳动物免疫系统主要由细胞免疫和体液免疫组成，其中细胞免疫通常是指血淋巴细胞直接参与的防御反应，主要包括细胞吞噬、包囊和黑化作用及凋亡等过程[20]。目前已在一些甲壳动物中观察到细胞皱缩、线粒体膜电位消失、膜内侧的磷脂酰丝氨酸暴露在外侧以及凋亡小体的形成等经典的凋亡特征[21]。细胞凋亡是免疫系统的一个重要调控特性，可以有效清理机体老化、受损或是存在潜在危险的细胞(如病毒感染细胞)，对维持机体免疫稳态具有重要意义。Caspases 是重要的半胱氨酸依赖的特异性蛋白酶，在细胞凋亡过程中发挥着核心作用。在墨吉对虾(Penaeus merguiensis)[22]、凡纳滨对虾[23]、斑节对虾(P.monodon)[24]和中华绒螯蟹[25]等甲壳动物中发现了凋亡相关的多种Caspase基因，较多的研究中采用注射细菌、病毒等方法对甲壳动物进行免疫刺激，来探究Caspase基因在甲壳动物免疫中的作用。Caspase-3 在哺乳动物的细胞凋亡过程中发挥重要的作用，在中华绒螯蟹中，Wu 等[26]首次发现EsCaspase-3-like基因，并发现其在甲壳动物血细胞凋亡过程中发挥重要的作用。本研究中采用dsRNA 对EsAkt基因进行干扰后，凋亡相关基因EsCaspase-3-like表达水平显著上调，提示EsAkt可能通过调控Caspase 介导的细胞凋亡，发挥其免疫调节的作用。本研究结果丰富了中华绒螯蟹PI3K-AKT 信号通路研究的基本资料，为进一步探究甲壳动物免疫防御机制奠定了基础。

（作者声明本文无实际或潜在的利益冲突）