粘细菌代谢产物对乳腺癌细胞抗性的作用

李俊达, 李松原, 张晰, 麻天雨, 刘涛, 刘惠荣*

(1.内蒙古农业大学生命科学学院, 呼和浩特 010018; 2.包头医学院内蒙古自治区低氧转化医学重点实验室, 包头 014060)

粘细菌(Myxobacteria)是一类分布广泛但分离培养较为困难的革兰阴性菌,有研究学者认为其是“生活在真核生物边缘”的高等原核细菌[1]。粘细菌能产生丰富的代谢产物,且这些产物往往有较高的生物抗性[2],如抗菌活性[3]、抗肿瘤[4-5]、抗人类免疫缺陷性病毒(human immunodeficiency virus,HIV)[6]等,此外,粘细菌还在铁氨氧化循环[7]、生物农药开发中展现出巨大潜力,这些特性使粘细菌越来越受到药物开发领域的科研工作者重视,成为重要的药源微生物。

上述这些优势条件对粘细菌开发成各类新药奠定了良好的基础,也使得粘细菌成为重要的药源微生物。近年来,随着人们对粘细菌的更深入了解和开发,研究人员将研究目标转为粘细菌代谢产物的安全性评价[8]、化合物修饰[9-12]以及粘细菌潜在价值的生物信息学开发[13],但发现新型药物仍是研究热点,同时也是化合物加工修饰、生物信息学开发完善的基础。

近年来,在全球范围内,乳腺癌的发病率和致死率逐年上升,对人类,尤其对女性的生命健康造成了严重威胁。据中国国家癌症中心统计,2015年乳腺癌发病率居中国女性恶性肿瘤发病的首位,每年新发病例约30.4万例,致死率高,居全部女性恶性肿瘤的前五位[14]。寻找预防乳腺癌的免疫疗法以及患后新型药物治疗成为重中之重,目前,乳腺癌的免疫疗法处于新发展阶段[15],新型药物治疗仍是患后的良好方案。

1 材料与方法

1.1 细胞株

实验所用人乳腺癌MCF-7细胞株由内蒙古农业大学生命科学学院万方教授惠赠。

1.2 主要试剂及仪器

CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、NaOH等分析纯化学药品,国药集团化学试剂有限公司;细胞增殖-毒性检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8),兰杰柯科技有限公司;生化培养箱,上海一恒科技仪器有限公司;CO2细胞培养箱,美国NuAire;生物安全柜,美国NuAire;酶联免疫检测仪,美国伯腾仪器有限公司;荧光倒置相差显微镜,日本Nikon;SMZ 745T体式显微镜,日本Nikon。

1.3 试验培养基

菌株的扩大培养和发酵培养分别使用VY/2固体培养基、VY/2液体培养基[16],MCF-7人乳腺癌细胞复苏、传代培养使用Gibco公司DMEM液体培养基并加入10%的胎牛血清培养。

1.4 菌株的分离及鉴定

参照廖继燕等[16]对采集土壤进行处理及粘细菌分离,反复纯化直至无杂菌生长,对生长状态良好的粘细菌菌株通过体式显微镜观察其菌落、子实体的形态,并参照《伯杰细菌鉴定手册》[17]初步判断菌株种属。采用CTAB/NaCl法提取上述粘细菌的DNA[18],对提取得到的DNA进行浓度和纯度检测。其后,使用正向27F和反向1495R的细菌通用引物[19]对其进行16S rDNA序列特异性扩增,电泳检测后送至北京博迈德公司测序。

1.5 菌株的发酵培养及其代谢产物的提取

采用前期课题组粘细菌发酵优化参数条件[20],即在100 mL的VY/2液体培养基中,加入2 g大孔树脂,按接菌量10%,在30℃、摇瓶震荡发酵7 d,收集大孔树脂,晾干后,加入100 mL甲醇,摇瓶震荡24 h,收集大孔树脂甲醇浸提物,经旋蒸、干燥后,使用1 mL甲醇溶解,用0.22 μm滤膜进行过滤除菌,定为原始浓度,即浓度为1.00×,将原始浓度液体稀释2倍,即浓度为0.50×,将原始浓度液体稀释4倍,即浓度为0.25×。

1.6 菌株代谢产物的CCK-8细胞毒性检测

通过CCK-8法检测粘细菌代谢产物对MCF-7细胞的毒性[21]。收集处于对数生长期的MCF-7细胞接种于96孔培养板上,细胞数量为1×104个/孔,培养体系为100 μL,培养24 h后,分别加入10 μL 0.25×、0.50×、1.00×的菌株代谢产物至96孔板中,在37 ℃、饱和湿度5%CO2条件下进行培养。设置实验组及对照组如下。

(1)空白实验组(Ab):培养基。

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(2)对照组(Ac):细胞、培养基。

(3)实验组(As):细胞、培养基、各浓度粗提发酵产物/等体积甲醇。

每组设置3个生物学重复。在培养24、48、72 h时,观察细胞形态,然后在各孔中分别加入CCK-8溶液10 μL,孵育1 h,并通过使用酶联免疫检测仪检测450 nm波长下样品的吸光度,计算各处理组抑制率I,公式为

I=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]×100%

(1)

式(1)中:I为抑制率;Ac为细胞、培养基和CCK-8的吸光度;As为细胞、培养基、CCK-8和各浓度粗提发酵产物或甲醇的吸光度;Ab为培养基和CCK-8的吸光度。

2 结果与分析

2.1 粘细菌的分离与鉴定

对采集自鄂尔多斯地区的部分土壤样品进行粘细菌分离,子实体反复纯化得到7个菌株。通过肉眼及体式显微镜观察7株菌的菌落和子实体形态(图1),根据形态特征,对照《伯杰细菌鉴定手册》中粘细菌形态特征,初步鉴定结果如下。

图1 代表菌株的菌落、子实体形态Fig.1 Morphology of colonies and fruiting bodies of the myxobacterial strains

(1)E44菌株。子实体为椭球形、粉色、基部有短状柄结构,具有折光性,不规则点状分布,且可产生透明粘液,菌落呈现薄膜状、不规则边缘,通过比对,该菌株可能为黏球菌科珊瑚球菌属的珊瑚状珊瑚球菌(Corallococcuscoralloides)。

(2)E603、E1201、E1202菌株。子实体呈圆形或椭圆形、连续培养潮解,介于黄色到黄绿色,菌落边缘不规则,但中间菌落形态清楚,有一定的扩散性色素,这些菌株可能为粘球菌科粘球菌属的变绿粘球菌(Myxococcusvirescens)。

(3)E701、E703、E705菌株。子实体为球形或椭球形、下端收紧、橙色且有柄状结构,有折光性,呈现出不规则点状分布,并伴有透明的膜包被,菌落形态呈现出圆形延展,形态饱满,有半透明的膜,通过比对,这些菌株可能为粘球菌科粘球菌属的橙色粘球菌(Myxococcusfulvus)。

虽然粘细菌的菌落大小形态及子实体形态作为粘细菌鉴定的重要指标,但由于粘细菌在多次纯化转接中容易发生特征消失,例如子实体变形、退化等现象,故借用分子生物学手段鉴定菌株尤为重要。

提取7株菌株的基因组DNA,使用细菌通用引物扩增菌株的16S rDNA序列并测序,测序后将序列进行BLAST比对,选择相似度高的序列通过MEGA-7绘制系统进化树。

如图2所示,菌株E44与珊瑚状珊瑚球菌(C.coralloides)模式菌株聚在同一分支;菌株E603、E1201、E1202与粘球菌属变绿粘球菌(M.virescens)模式菌株聚在同一分支;菌株E701、E703、E705与粘球菌属橙色粘球菌(M.fulvus)模式菌株聚在同一分支。结合形态学鉴定结果与16S rDNA分子生物鉴定结果相似,表明结果可靠,基本可确定E44属于珊瑚球菌属珊瑚状珊瑚球菌,E603、E1201、E1202属于粘球菌属变绿粘球菌,E701、E703、E705属于粘球菌属橙色粘球菌。

图2 基于16S rRNA基因序列的粘细菌菌株系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree of myxobacterial strains based on 16S rRNA gene sequence

2.2 菌株代谢产物对MCF-7细胞的影响

制备菌株代谢产物的甲醇抽提物,以不同稀释度的代谢产物处理MCF-7细胞24、48、72 h后,将96孔板置于显微镜下观察。结果显示,不同浓度的菌株E44代谢产物在不同处理时间上,均对MCF-7细胞产生影响,与甲醇对照相比,细胞数量明显减少,细胞形态出现明显变化,细胞变圆,部分可见细胞碎片,这表明E44菌株代谢产物对MCF-7细胞的增殖可能起到了抑制作用,其他菌株的代谢产物检测结果类似,均对MCF-7细胞形态、数量产生类似影响(图3)。

2.3 菌株代谢产物对MCF-7细胞的抑制率

通过CCK-8法检测菌株代谢产物对MCF-7细胞的抑制率(表1)。7株粘细菌的代谢产物均对人乳腺癌细胞MCF-7产生不同程度的抑制作用。

表1 菌株代谢产物对MCF-7细胞的抑制率Table 1 Inhibition rate of metabolites of the strains on MCF-7 cells

7株菌中,M.fulvusE701代谢产物对细胞的抑制作用最强,0.50×代谢产物处理24 h对细胞的抑制率最高,达106.29%,0.25×代谢产物处理48 h的抑制率最低,为65.27%,所有处理组的细胞抑制率均达到50%以上。M.virescensE1202代谢产物对细胞的抑制作用最弱,其中1.00×代谢产物处理48 h的抑制率在该组中最高,为70.45%,0.50×代谢产物处理24 h的抑制率最低,仅为4.08%,其中仅有3个处理组的抑制率达到50%以上,有6个处理组的抑制率在50%以下。

此外,C.coralloidesE44最佳处理组为0.50×代谢产物处理48 h,抑制率为94.90%,0.25×代谢产物处理72 h的抑制率最低,为48.93%,其中,8个处理组抑制率达到50%以上,1个处理组的抑制率在50%以下;M.virescensE603最佳处理组为1.00×代谢产物处理24 h,抑制率为92.18%,0.25×代谢产物处理72 h的抑制率最低,为46.46%,其中,7个处理组的抑制率达到50%以上,2个处理组的抑制率在50%以下;M.fulvusE703最佳处理组为1.00×代谢产物处理48 h,抑制率为89.98%,0.50×代谢产物处理72 h的抑制率最低,为12.09%,其中,5个处理组的抑制率达到50%以上,4个处理组的抑制率在50%以下;M.fulvusE705最佳处理组为1.00×代谢产物处理48 h,抑制率为86.26%,0.25×代谢产物处理24 h的抑制率最低,为7.45%,其中,5个处理组的抑制率达到50%以上,4个处理组的抑制率在50%以下;M.fulvusE1201最佳处理组为0.50×代谢产物处理72 h,抑制率为93.84%,0.25×代谢产物处理24 h和48 h的抑制率最低,均为10.38%,其中,有3个处理组的抑制率达到50%以上,有6个处理组的抑制率在50%以下。

3 讨论

粘细菌代谢产物的抗肿瘤相关研究一直是新药研究的一大热点,自从埃博霉素(Epothilones)等[22]一系列粘细菌代谢产生的新型药物相继发现以来,粘细菌成为发现新型药物的重要类群。

Lee等[4]分析研究分离自韩国不同生境的130株粘细菌代谢产物对人乳腺癌MCF-7细胞的影响,其中有33株粘细菌代谢产物对MCF-7细胞有生长抑制作用,分属于8种不同种属,包含与本实验相同的3个种属,在33株菌株中,M.fulvusKYC4030、M.fulvusKYC4048以及C.coralloidesKYC4081的代谢产物均具有高抗癌活性和低细胞毒性,对MCF-7的抑制率分别为31.0%、72.5%、52.5%,除此之外的其他菌株,由于抗癌活性和细胞毒性相差不大或细胞毒性过强并未进行更为翔实的实验。其中M.fulvusKYC4048的代谢产物抗肿瘤活性最高且无细胞毒性,通过拮抗Wnt/β-Catenin信号通路进而抑制MCF-7的细胞增殖[23],在本实验研究中,M.fulvusE701的代谢产物对MCF-7细胞的抑制效果最佳,C.coralloidesE44也对MCF-7有着较好的抑制效果,与上述研究结果类似。

此外,也有相关研究学者探究了粘细菌对其他肿瘤细胞的抑制效果,Kumar等[24]研究分离自印度北部平原的9株粘细菌代谢产物对人肝癌HepG2细胞、人子宫颈癌HeLa细胞、人骨肉瘤MG-63细胞以及人前列腺癌PC-3细胞的抑制效果,结果表明所有粘细菌对上述肿瘤细胞均有抑制作用,同属于Corallococcussp.S145、Myxococcussp.S199菌株代谢产物对人前列腺癌PC-3细胞的抑制效果最好,抑制率分别为86%、76%。Sharma等[25]研究了分离自喜马拉雅西北部的10株粘细菌代谢产物对MCF-7细胞、PC-3细胞、人肺癌A549细胞以及人结肠癌HVT-116细胞的抑制效果,同样,10株粘细菌均对上述4种肿瘤细胞有抑制效果,且存在差异,M.virescens2A对上述4种肿瘤细胞均达到70%以上的抑制率,且对MCF-7细胞、A549细胞、HVT-116细胞抑制率达90%以上,M.fulvusST/P/71在本组实验中效果最佳,上述4种肿瘤细胞抑制率高达86%以上,除PC-3细胞外,其他细胞抑制率高达96%以上。黄同龙等[26]进行了相关的研究,探讨了Myxococcussp.STXZ90代谢产物对多种肿瘤细胞的影响,其中该菌株对人肝癌Hep-3B细胞有着较强的抑制效果,抑制率为90.06%。此外,该课题组还探究了两株叶柄粘球菌对肿瘤细胞的影响,结果表明叶柄粘球菌CA3对人肝癌SMMC-7721细胞抑制效果明显,抑制率为50.2%[16],叶柄粘球菌STXZ77对小鼠黑色素瘤细胞B16具有明显的抑制作用,且细胞毒性较低[27]。这些研究说明,粘细菌的抗肿瘤活性非常显著,而研究所分离到的粘细菌菌株是否也对这些肿瘤细胞具有拮抗作用,需要今后进一步研究。

Lee等[4]、Sharma等[25]研究均表明同种菌株拮抗效果存在菌株间特异性,在Lee等[4]的研究中,8株M.fulvus对 MCF-7抑制率介于31.0%～72.5%,3株M.virescens对MCF-7抑制率介于48%～83.5%,4株C.coralloides对 MCF-7抑制率介于17%～62.5%;Sharma等[25]研究中,同属于M.virescens的2A和2B对MCF-7、A549、PC-3、HVT-116细胞的抑制效果差异巨大,如M.virescens2A对HVT-116细胞抑制率为98%,但M.virescens2B对HVT-116细胞抑制率仅为1%,其他3种肿瘤细胞的抑制率也差异较大,且M.virescens2A远高于同种属的M.virescens2B,此外,M.fulvusST/P/7与同种属的其他菌株对上述肿瘤细胞抑制效果存在较大的差异,如M.fulvusST/P/7对MCF-7、HVT-116的抑制率分别为96%、98%,但M.fulvusK/ST/GD/3(2)对这两种细胞并没有抑制作用。上述这种现象与研究结果相似,无论是M.fulvusE701、E703、E705还是M.virescensE603、E1201、E1202其抑制率也存在较大的种间差距。

王军等[28]通过高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)分离M.fulvus15代谢产物得到的5号代谢产物对人肝癌HepG2细胞有着良好的抑制效果,这更加精确了M.fulvus15抑制HepG2细胞的具体物质;鞠培殿[29]通过研究表明,C.coralloides085B04的馏分均对MCF-7均有抑制效果,其中第138号馏分的化合物19效果最好;Sharma等[25]通过分离M.fulvusST/P/71代谢产物得到化合物1,其特征为邻苯二甲酸二异丁酯(DiBP),对人肺癌A549细胞有良好的抑制作用和商业利用价值。本实验检测了7个粘细菌菌株甲醇粗提代谢产物的抗乳腺癌细胞活性,结合前人研究结果表明实验鉴定的7株菌株均有可能存在对人乳腺癌细胞有抑制作用的代谢产物,今后对代谢产物活性成分的分离及作用机制研究是新药研发的关键一环,相关研究具有重要的意义。

4 结论

粘细菌作为代谢产物新颖、丰富的代表,作为重要的药源微生物,从中寻找新型、低细胞毒害的代谢产物,是为乳腺癌治疗提供新型药物的有效途径之一。实验初步探究了内蒙古鄂尔多斯地区分离到的7株粘细菌代谢产物对人乳腺癌MCF-7细胞的作用,系国内首次报道了变绿粘球菌(Myxococcusvirescens)对人乳腺癌MCF-7细胞的影响,为接下来粘细菌代谢产物对人乳腺癌作用的相关研究奠定基础。