噬菌体展示疫苗的研究进展

王财，赵子红 综述，李唯峰，张玉妥 审校

河北北方学院病原生物学与免疫研究所，河北张家口075000

噬菌体展示疫苗是一种基于噬菌体展示技术开发的新型疫苗制备技术，其利用噬菌体作为载体，将外源多肽或蛋白基因重组至噬菌体基因组中，以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，从而实现疫苗的制备［1-2］。与传统疫苗比较，噬菌体展示疫苗具有免疫源性强，能够表达天然蛋白构象，制备简单等优点，因此受到广泛关注和研究。自1985 年SMITH［3］开创了噬菌体展示技术以来，基于该技术研发的噬菌体展示疫苗的报道陆续涌现。目前，研究人员利用此技术开发了多种新型疫苗，涉及病毒、细菌、真菌等领域。虽然噬菌体展示疫苗取得了突破性的进展，但仍面临一些挑战，如最佳噬菌体展示系统的选择、噬菌体展示系统稳定性的优化等方面均需深入研究。本文就噬菌体展示疫苗的免疫学基础、展示系统种类及其在疾病预防应用的研究进展作一综述，以期为噬菌体展示疫苗的研发与应用提供参考。

1 噬菌体展示疫苗的免疫学基础

1.1噬菌体免疫原性 噬菌体本身固有的免疫原性是构建噬菌体展示疫苗的优势所在。目前较为认可的机制是噬菌体基因组内存在较高比例的脱氧胞苷-磷酸-脱氧鸟苷（cytidine-phosphate-guanosine，CpG）序列，CpG寡核苷酸参与Toll样受体9（Toll-like receptor 9，TLR9）信号级联反应，促进炎性反应及抗原提呈细胞（antigen-presenting cells，APCs）的成熟，并增强其噬菌体肽抗原向B细胞和T细胞高效呈递，激活适应性免疫反应［4］。DONG 等［5］研发了一种基于M13 噬菌体的疫苗递送平台，可通过简单的吸附递送多种肿瘤特异性抗原，证明该平台可通过TLR9信号通路激活抗原呈递细胞，从而增强先天性和适应性免疫反应。GOMES-NETO 等［6］研究表明，重组丝状噬菌体通过TLR9 依赖性机制诱导特异性IgG 和CD8+T细胞介导的免疫反应，可为人类寄生虫感染提供保护。SARTORIUS 等［7］研发了一种基于丝状噬菌体fd颗粒通过DEC-205 传递抗原决定因子的递送系统（fd displaying an anti-DEC-205 single-chain-variable fragment，fdsc-αDEC），即使在无佐剂或树突状细胞（dendritic cells，DCs）刺激的情况下，也能诱导CD8+T 细胞反应，进一步证实了fdsc-αDEC 是依赖TLR9信号通路的激活来诱导促炎细胞因子与Ⅰ型干扰素分泌的。GOGOKHIA 等［8］阐明了一种肠道噬菌体以TLR9 依赖的方式驱动Ⅰ型干扰素的产生。因此,噬菌体的固有免疫原性在一定程度上为噬菌体展示疫苗的发展奠定了基础。

1.2噬菌体展示疫苗免疫机制 以噬菌体为载体的疫苗发挥免疫作用的关键之一取决于B 细胞抗原表位（B-cell epitopes，BCEs）和T 细胞抗原表位（T-cell epitopes，TCEs）的选择［9］。目前，普遍认为噬菌体展示疫苗被细胞内吞，通过APCs 加工提呈，经MHCⅠ和MHCⅡ类分子途径诱导CD4+和CD8+T细胞免疫，同时经B 细胞提呈诱导体液免疫［10］。SINHA 等［11］研究显示，fd 丝状噬菌体能够触发所有的免疫反应，特别是表面展示的MHCⅠ类限制性抗原决定簇诱导的细胞毒性T 淋巴细胞反应（cytotoxic T lymphocyte，CTL）。另有研究发现，fd 噬菌体可靶向小鼠DCs，在不需要外源性佐剂的情况下激活先天和适应性免疫反应。有研究报道，以白色念珠菌Fba1表位YGKDVKDLFDYAQE构建的丝状噬菌体展示疫苗免疫小鼠能够诱导强烈的体液和细胞免疫反应，还可在细胞免疫方面增强Th1（IFNγ，IL-2）和Th17（IL-17）型细胞因子水平，这可能在抗白色念珠菌保护中发挥重要作用［12-13］。MASCOLO 等［14］研究表明，重组噬菌体在小鼠体内引起的CTL 效应反应也许是在噬菌体衣壳蛋白刺激增殖的CD4+T 细胞辅助下所产生的，这可能是由于噬菌体外壳蛋白不表达或低表达共刺激分子所致。有研究报道，丝状噬菌体pⅧ外壳蛋白上的高拷贝B 细胞表位能诱导体液免疫［12］。而针对单一肽产生的体液免疫并不能提供有效保护能力，另外，在抗体滴度和记忆方面的个体间差异也是一项重要的挑战，使用展示多个不同抗原表位的噬菌体混合物可能是克服该问题的方法之一［13］。

2 噬菌体展示系统

2.1丝状噬菌体（filamentous bacteriophage）展示系统丝状噬菌体是一类F+大肠埃希菌专一性噬菌体［15］。用于噬菌体展示的主要是Ff组的M13、f1、fd噬菌体，此类噬菌体介于温和噬菌体和毒性噬菌体之间，在感染宿主后使宿主细胞处于一种慢性感染状态，噬菌体颗粒从宿主细胞中缓慢释放，宿主细胞仍保持继续生长和分裂。丝状噬菌体由蛋白质外壳与环状单链DNA（cssDNA）组成，基因组长度为6 408 bp，共有11个基因组成，编码11种蛋白，其中编码5种衣壳蛋白分别为pⅢ、pⅥ、pⅦ、pⅧ和pⅨ［15］。由于pⅢ和pⅧ蛋白处于噬菌体结构的固定位置，二者常用于展示系统的构建。次要衣壳蛋白pⅢ约含5个拷贝，由于噬菌体拷贝数较少，在一定程度上空间结构的影响可忽略不计，因此，pⅢ蛋白更适合表达较大的多肽，但表现出低免疫原性［16］。与之相比，pⅧ为主要衣壳蛋白，约含2 700个拷贝，提供更高水平的免疫原暴露，因此，pⅧ表现出的免疫原性更强，广泛应用于疫苗的研制。同时也亟需一种策略解决只能展示短肽的局限性，最大限度地提高系统的展示灵活性［16-17］。

SHI等［12］将白色念珠菌Fba1 上一个优势表位肽（YGKDVKDLFDYAQE）展示于丝状噬菌体fUSE55 pⅢ与F88-4 pⅧ上，构建了两种展示噬菌体疫苗，结果表明，两种展示噬菌体疫苗均能明显诱导感染小鼠的体液和细胞免疫应答，减轻白色念珠菌感染所致肾脏损伤状况，并显著提高小鼠存活率。该研究在一定程度上体现出YGKDVKDLFDYAQE-丝状噬菌体展示疫苗成为新型白念珠菌候选疫苗的潜力。GONZáLEZ-MORA 等［18］在M13噬菌体表面展示了牛蜱虫蛋白Bm86 上的多肽Sbm746，结果表明，所设计的疫苗能够诱导牛单核细胞源性树突状细胞（monocyte derived dendritic cells，Mo-DCs）成熟和外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）增殖，通过ELISA 法及斑点印迹免疫检测技术有效鉴定了靶标抗原的表达。因此，M13噬菌体展示平台有望成为兽疫领域生产新型、稳定和高效益疫苗的关键技术。STAQUICINI 等［19］采用fd 衍生噬菌体在主要衣壳蛋白pⅧ上展示了严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory symptom coronavirus 2，SARS-CoV-2）蛋白抗原表位（aa 662-671），在次要衣壳蛋白pⅢ上展示了肺靶向肽CAKSMGDIVC，构建了噬菌体双展示疫苗。结果显示，该疫苗经黏膜免疫诱发了小鼠系统性和特异性的免疫反应。丝状噬菌体是一种使用最为广泛噬菌体展示系统，但其存在一个关键性难题，即该噬菌体属于非裂解增殖，展示的肽或蛋白质必须通过宿主细胞内膜分泌才能重新组装，因此所展示的肽或蛋白质的长度、序列和空间结构在一定程度上受到限制［20］。

2.2Lambda 噬菌体展示系统 Lambda 噬菌体由二十面体头部（直径约60 nm）和弯曲的尾部（长约150 nm）组成［20］，是一种温和的噬菌体，包含溶原性和溶菌性2个周期。Lambda噬菌体含有48 500 bp线性dsDNA，分子两端有12 个碱基组成的黏性末端，在感染大肠埃希菌后，黏性末端环化形成环状DNA分子。Lambda噬菌体外部由主要衣壳蛋白gpD 和gpE、门户蛋白gpB、支架蛋白gpNu3、病毒蛋白gpC 和尾蛋白gpV 组成。Lambda噬菌体展示技术系统通常采用头蛋白D和尾蛋白V作为展示位点，D蛋白在头部空间结构中比较突出，易与配体结合，可将外源蛋白质在此融合；尾蛋白V 具有2 个折叠结构域，C-末端不是必需的，可被外源多肽或蛋白质取代，不会明显影响噬菌体的增殖。与尾蛋白V 比较，头蛋白D 由于拷贝数更多，更适合作为展示位点。

DAVENPORT 等［21］开发了一种基于Lambda 噬菌体优化的噬菌体样颗粒（phage-like particle，PLP），设计了展示SARS-CoV-2和MERS-CoV 表位的3款疫苗（RBDSARS-PLPs，RBDMERS-PLPs 及联合疫苗hCoVRBD PLPs）。结果显示，用RBDSARS-PLPs 和RBDMERSPLPs 免疫的BALB／c 小鼠可诱导产生具有中和活性的抗体；仅用1µg的RBDSARS-PLPs免疫就能产生高滴度抗体，且这些抗体在发病后6个月仍保持较高水平。在攻毒试验中，用RBDSARS-PLPs、RBDMERS-PLPs和hCoV-RBD PLPs 免疫的小鼠对SARS-CoV-2 和MERS-CoV 的感染具有保护作用。这些数据表明，基于Lambda噬菌体优化的PLP系统为高效产生单靶点或多靶点疫苗提供了一个可靠平台。GONZáLEZCANO 等［22］在Lambda噬菌体头部蛋白D上展示了鹿朊病毒蛋白的3 个特异性表位，构建了朊病毒噬菌体展示疫苗LDP（lambda display phage）-DSE（disease specific epitopes）。结果表明，在无佐剂的情况下，经黏膜给药可诱导强烈的IgA 抗体反应。LDP-DSE 噬菌体展示疫苗能够在消化道中生存下来，具有成为口服疫苗递送系统的潜力。与丝状噬菌体比较，Lambda 噬菌体可在D 蛋白上展示更复杂的蛋白，且使许多在其他噬菌体展示系统中难以通过膜分泌的多肽或蛋白得以展示。虽然Lambda 噬菌体具有诸多优势，但仍有一些问题限制了Lambda 噬菌体的广泛应用［20］。由于Lambda 噬菌体属于温和噬菌体，其形式表现出多样化：①具有感染性的噬菌体颗粒游离态；②宿主菌细胞质内类似质粒形式的噬菌体核酸；③前噬菌体（整合在细菌染色上的噬菌体基因）。这种复杂的生物学特性使Lambda 噬菌体展现出比丝状噬菌体更低的免疫原性，且由于Lambda 噬菌体基因组更大，使基于分子水平的操作更加复杂。

2.3T4 噬菌体展示系统 T4 噬菌体是一种感染大肠埃希菌的毒性噬菌体［20］，由头部、尾部和12 个尾部纤维组成。成熟T4噬菌体的头部是一个扁长的二十面体衣壳，包裹着线性dsDNA 基因组（168 000 bp）。头部被9～19 种蛋白质所覆盖，其中Hoc（相对分子质量约40 000，包括155～160个拷贝）和Soc（相对分子质量约9 000，包括810～960 个拷贝）是在衣壳组装完成后结合至衣壳外表面的2 个非必需蛋白［16］，Hoc和Soc具有较强的抗原性，常用于构建T4噬菌体展示系统，该系统不仅可在单个Hoc 或Soc位点上展示外源肽或蛋白，还可在Soc和Hoc 位点上展示双重外源肽或蛋白。

TAO 等［23］构建了一种以T4 噬菌体为平台的炭疽-鼠疫双展示疫苗，将炭疽保护性抗原（anthrax protective antigen，PA）、鼠疫杆菌Ⅲ型分泌体的囊膜抗原F1 和低钙反应V 抗原突变体（F1mutV）融合至外壳蛋白Soc 上。结果表明，炭疽-鼠疫双展示疫苗在小鼠、大鼠和兔3 种动物模型中均可激发强烈的特异性免疫反应，在攻毒试验中均可提供完全保护。因此，T4噬菌体有望成为构建多价疫苗的通用平台。LI 等［24］将流感基质蛋白2 胞外域（influenza matrix protein 2 ectodomain，M2e）展示在T4 噬菌体样颗粒（T4 virus-like particle，VLP）上，制备成M2e-T4 VLP噬菌体展示疫苗。结果表明，在无任何佐剂的情况下，可诱发强烈的体液和细胞免疫反应，具有超强的免疫原性，且对致命流感病毒攻击具有保护能力。HASHEMI 等［25］用T7 噬菌体展示M2e，结果显示，虽然可诱导针对多种亚型甲型流感病毒的保护性抗体，但不能完全预防致死性流感病毒的攻击，这可能是由于T7 噬菌体衣壳上M2e 分子拷贝数较低所致。DENG 等［26］将M2e 展示在f88 噬菌体外壳蛋白pⅧ上，虽然外壳蛋白pⅧ多达2 700个拷贝，但仅有部分M2e 可展示在噬菌体f88 表面上。T4 噬菌体的优势在于其衣壳蛋白Soc 和Hoc 为高密度的抗原分子提供了展示平台，可用于展示不同大小的抗原分子，甚至全长蛋白质，这是该噬菌体展示系统所特有的。

2.4T7 噬菌体展示系统 T7 噬菌体属于毒性噬菌体［20］，在细胞质中组装并通过裂解细菌释放，具有独立于大肠埃希菌的分泌机制。其头部是包裹线性dsDNA的二十面体衣壳，由415个拷贝的衣壳蛋白组成，具有完美的结构对称性。在T7噬菌体展示系统中，用于展示多肽或蛋白的衣壳蛋白通常包括10A和10B 2种形式，分别由344和397个氨基酸组成，后者是由前者的341位氨基酸的翻译移码形成的［27］。

XU 等［28］将口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）结构蛋白VP1 的G-H 环编码入T7 Select 415-1b 载体，构建了重组T7-GH 噬菌体展示疫苗，评估单剂量免疫后的效果。结果表明，与两种市售FMDV 疫苗（InactVac 和PepVac）比较，VP1／LPBE抗体滴度及抗原特异性淋巴细胞增殖率与PepVac组相当，但弱于InactVac组，免疫保护率为80%（4／5），表明FMDV 噬菌体展示疫苗具有良好的免疫原性。WU 等［29］将FMDV AKT-Ⅲ株的结构蛋白VP1 于T7噬菌体衣壳表面展示，结果表明，免疫BALB／c小鼠后能够快速产生高滴度的FMDV 抗体，且抗体可在较长时间内维持在较高水平。体外试验表明，AKT-T7噬菌体展示疫苗对仓鼠肾细胞（BHK-21）、牛肾细胞（MDBK）和羊肾细胞均未产生细胞毒性。LIU 等［30］开发了ΦC31 整合酶介导的T7 噬菌体体内整合系统，该系统允许快速敲入超过2 000 bp 的外源DNA，而不会损害其结构完整性。T7噬菌体主要具有以下优势：①呈双链DNA，具有良好的稳定性，在复制过程中不易发生突变；②子代噬菌体的组装在细菌细胞质中进行，通过细胞膜裂解而释放，因此展示的肽段或蛋白无大小限制和分泌过程导致的宿主毒性风险；③增殖速度比丝状和Lambda 等噬菌体更快，在3 h 内即可产生空斑，节省了大量的克隆和筛选时间；④在其他噬菌体不能存活的极端条件（pH 与温度）下的稳定表达。这些优势使T7 噬菌体展示系统更具吸引力［31］。

3 噬菌体展示疫苗的应用

3.1细菌感染性疾病的预防 TAO等［23］通过T4噬菌体展示系统构建了炭疽-鼠疫双展示噬菌体疫苗，该疫苗成功诱导了强烈的炭疽杆菌和鼠疫杆菌特异性免疫反应，并在3 种动物（小鼠、大鼠和兔）攻毒模型中对吸入性炭疽杆菌和鼠疫杆菌提供了完全保护，即使同时受到致命剂量的炭疽杆菌和鼠疫杆菌攻击，这种保护仍有效。因此，T4噬菌体展示系统对于研制高危细菌病原体多价疫苗具有巨大潜力，是一种独特的疫苗递送平台。

3.2病毒感染性疾病的预防 LI等［24］利用T4 VLP平台开发了一种基于M2e 的流感噬菌体展示疫苗，在不使用任何佐剂的情况下，可诱导强烈的免疫反应，并对流感病毒感染的小鼠提供了不同的保护作用［32-35］。STAQUICINI 等［19］通过丝状噬菌体fd 展示系统构建了SARS-CoV-2 噬菌体双展示疫苗，一定程度上弥补了传统疫苗的缺陷，基于噬菌体展示技术的递送平台有可能成为研发病毒疫苗的得力助手。

3.3真菌感染性疾病的预防 白色念珠菌（Candida albicans）是一种机会性真菌病原体，特别是针对免疫功能低下的人群，目前，临床上仍缺乏有效的预防和治疗策略，因此亟需开发有效的防治制剂。SHI等［12］采用丝状噬菌体展示系统展示了白色念珠菌Fba1的肽表位，构建了2种噬菌体展示疫苗（噬菌体-3F 和噬菌体-8F）。结果表明，该疫苗对感染小鼠具有明显的保护作用。球孢子丝菌是一种真菌，通常感染免疫功能低下的人群，目前仍无任何可以预防球孢子菌病的方法，临床上常建议尽量避免参与环境中产生较多粉尘的相关活动。一种被称为70 kDa的糖蛋白（Gp70）是球孢子丝菌细胞表面的主要黏附因子，是一种与真菌毒力相关的交叉免疫原性蛋白。CHEN 等［36］将Gp70 的表位多肽Kpvqhaltplgldr 展示在fuse5 主要外壳蛋白pⅢ上，构建球孢子丝菌噬菌体展示疫苗，结果显示，该疫苗可诱导小鼠产生中和抗体，抑制球孢子丝菌的感染，提高存活率。

3.4寄生虫病的预防 牛蜱（Rhipicephalus microplus）是一种寄生在全球热带和亚热带地区牛体表的吸血寄生虫［37-38］。GONZáLEZ-MORA 等［18］以牛蜱蛋白Sbm7462 上短肽Bm86 为抗原展示在M13 噬菌体上，制备了牛蜱噬菌体展示疫苗，采用牛单核细胞来源的DCs 进行体外试验，结果证明，疫苗具有免疫原性，但仍需在牛模型中进一步评估其免疫原性及安全性。肝片形吸虫病是一种全球范围内出现的人畜共患病［39］，VILLA-MANCERA 等［40］将组织蛋白酶肽表位CL1（TPWKDKQ）、CL2（YGSCFLR）以单独和联合的形式展示在M13 噬菌体上，制备了肝片形吸虫噬菌体展示疫苗，通过评估对感染囊蚴绵羊的吸虫大小与数量、粪便卵数目、肝酶血清水平等方面来验证疫苗的有效性。结果表明，以CL1 为肽表位构建的组别效果最佳，可诱导产生IgG 特异性抗体，对肝片形吸虫的感染具有保护作用，能够有效预防肝片形吸虫的感染。

4 小结与展望

噬菌体展示疫苗的优势主要有：①在无需佐剂的条件下即可有效诱导产生保护性抗体；②通过细菌培养即可实现规模化生产；③运输和储存成本比传统疫苗更加经济，方式更加便捷；④人体给药安全；⑤即使在相对较低的剂量下，也能获得比传统疫苗更好的免疫效果。但也存在一些缺陷：噬菌体虽然不会对人体致病，但在噬菌体展示疫苗获得批准之前还需对噬菌体的生物学特性进行全面研究，并进行临床试验以对其安全性进行评估。关于噬菌体展示疫苗引发免疫应答的潜在机制尚未明确，还需进行大量的基础研究与临床试验。综上所述，噬菌体展示疫苗虽不能克服疫苗生产领域面临的所有障碍，但仍是疾病防治领域一种具有竞争力的候选疫苗。