分型鉴别HPIV1、HPIV2及HPIV3多重荧光定量RT-PCR方法的建立及验证

程子恩，刘芷宁，曹鹏程，赵亚齐，侯广争，刘琪琦，刘馨，3

1.锦州医科大学附属第一医院，辽宁锦州121001；2.军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所，北京100850；3.锦州医科大学葫芦岛市中心医院教学基地，辽宁锦州121001

20 世纪50 年代，Andrews 等将首次发现的与流感病毒、流行性腮腺炎病毒感染后症状相似，但与流感病毒抗原性不同，且具有独特的生物学特性的一种病毒命名为人副流感病毒（human parainfluenza virus，HPIV）。HPIV 是引起儿童、老年人、免疫抑制患者、基础营养状况差的人群呼吸道感染的重要病原体，可导致多种呼吸道疾病，包括感冒、哮吼、支气管炎、肺炎等［1-2］。在全球范围内，HPIV 是引起儿童呼吸道感染住院的第二大病原体，仅次于呼吸道合胞病毒，给各个国家带来了严重的疾病负担和公共卫生风险［3-5］。

根据HPIV的血清学及基因组特征，可分为HPIV1~4四种血清型。其中HPIV3是HPIV引起下呼吸道感染最常见的型别，然后依次为HPIV2、HPIV1和HPIV4［6-7］。HIPV4根据抗原性的不同又被分为4a和4b 2个血清亚型，引起的感染症状较轻微［8-9］。在5 岁以下儿童呼吸道感染病例中，至少有75% ~ 80%的儿童曾感染过HPIV［10］。成人12%呼吸道感染与HPIV有关［11］。虽然在结构上不同亚型HPIV 表现出高度的相似性，但各亚型病毒所致的临床特点和流行病学特征有显著差异［12］。人体感染HPIV 后不会产生完全的保护性免疫，终生均可能发生再感染，而目前尚无治疗和预防HPIV感染的特异性药物和疫苗［13-14］。

本研究选择HPIV1、HPIV2和HPIV3基因保守区域设计相应的引物及探针，以人核糖核酸酶P（RNase P）为内质控，建立同时检测HPIV1、HPIV2 和HPIV3的多重荧光定量RT-PCR 方法，并进行验证，以期在快速检测HPIV 感染的同时实现患者亚型的鉴别诊断，为临床HPIV 感染患者分型治疗提供诊断结果和理论依据。

1 材料与方法

1.1病毒、质粒及标准品 甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒灭活样本由军事医学研究院辐射医学研究所保存，新型冠状病毒灭活样本由该院微生物研究所提供；HPIV1、HPIV2、HPIV3 标准品购自广州邦德盛生物科技有限公司；pUC57 载体由北京博迈德基因技术有限公司提供。

1.2临床样本 192 份咽拭子样本由军事医学研究院辐射医学研究所保存并提供。本研究获得伦理委员会批准。

1.3主要试剂及仪器 5×Neoscript RT Premix Multi-UNG（Probe qRT-PCR）试剂盒购自珠海宝锐生物科技有限公司；质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit 购自德国QIAGEN 公司；7500 Real-Time PCR System 购自美国Applied Biosystems 公司；核酸／蛋白质荧光定量仪购自美国Unchained Labs 公司；新羿TD-1 微滴式数字PCR系统购自北京新羿生物科技有限公司。

1.4引物及探针设计 从国际公共数据库中下载HPIV1（MT232426.1）、HPIV2（LC486598.1）和HPIV3（MN145876.1）基因序列，利用DNAman 软件进行同源性分析，Primer express 3.0.1 软件进行引物及探针设计，Primer-BLAST 软件对设计的引物及探针进行特异性验证。RNase P引物及探针的设计参考美国疾病控制与预防中心引物及探针［15］。引物和探针序列见表1，由北京博迈德基因技术有限公司合成。

表1 引物及探针序列Tab.1 Primer and probe sequences

1.5重组质粒标准品的构建及核酸提取 将HPIV1、HPIV2、HPIV3 三种病毒和RNase P 的靶基因序列插入至pUC57 载体，构建重组质粒，测序后，鉴定正确的质粒分别命名为pUC57-HPIV1、pUC57-HPIV2、pUC57-HPIV3、pUC57-RNase P，该过程由北京博迈德基因技术有限公司完成。使用质粒提取试剂盒提取质粒，利用核酸／蛋白质荧光定量仪测定质粒浓度，按下式计算拷贝数。使用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取病毒样本核酸并于-80 ℃保存。

1.6多重荧光定量RT-PCR体系的优化及标准曲线建立 多重荧光定量RT-PCR反应体系参照Neoscript RT Premix Multi-UNG（Probe qRT-PCR）试剂盒说明书配制，将HPIV1、HPIV2、HPIV3和RNase P的上下游引物及不同荧光标记的探针加入反应体系，以相同浓度重组质粒标准品为模板，采用方阵法优化引物、探针浓度。用优化好的引物及探针体系优化退火温度。将pUC57-HPIV1、pUC57-HPIV2、pUC57-HPIV3、pUC57-RNaseP重组质粒标准品原液均制备成4×108copies／mL，按1∶1∶1∶1 混匀后10 倍稀释，选取5 个浓度（103~107copies／mL）质粒标准品混合物为模板，按照优化好的反应体系和条件进行荧光PCR扩增，以浓度的对数为横坐标，Ct值为纵坐标绘制标准曲线。

1.7方法的验证

1.7.1灵敏度 用新羿TD-1微滴式数字PCR系统对HPIV1、HPIV2、HPIV3核酸进行定量后的浓度分别为1.78×105、1.11×106、2.70×105copies／mL，用ddH2O将其分别稀释至1 000、500、250 和100 copies／mL，利用建立的多重荧光RT-PCR方法进行扩增，每个浓度进行20 个重复，以95%检出率的最低浓度确定为最低检测限。

1.7.2特异性 用建立的多重荧光定量RT-PCR 方法对甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、新型冠状病毒、HPIV1、HPIV2、HPIV3 核酸进行扩增，设ddH2O为阴性对照。

1.7.3精密度 以104、105、106copies／mL 的pUC57-HPIV1、pUC57-HPIV2、pUC57-HPIV3、pUC57-RNase P重组质粒标准品混合物为模板，用建立的多重荧光定量RT-PCR方法进行扩增，每种浓度重复3次，进行组内精密度分析；选取3 个不同的时间，进行组间精密度分析；计算变异系数（CV）。

1.8方法的初步应用 使用QIAamp Viral RNA Mini Kit 试剂盒提取192 份临床样本核酸，应用建立的多重荧光定量RT-PCR方法进行检测，阳性临床样本送北京天一辉远生物科技有限公司测序，对测序结果进行比对分析。

1.9数据采集及分析 采用Graphpad Prism 8.0软件进行数据处理及绘图。

2 结果

2.1质粒标准品的构建及鉴定 重组质粒pUC57-HPIV1、pUC57-HPIV2、pUC57-HPIV3、pUC57-RNase P经核酸／蛋白质荧光定量仪检测后的浓度分别为80、79、154、42 ng／µL，换算成拷贝数分别为2.43×1012、2.40 × 1012、4.68 × 1012、1.27 × 1012copies／mL，作为多重荧光定量RT-PCR的标准品。

2.2多重荧光定量RT-PCR体系的优化及标准曲线经优化后，确定反应体系为30µL，其中10×Neoscript-RTase／UNG Multi mix 3 µL，5 × Neoscript RT Premix Multi Buffer 6µL，HPIV1、HPIV2、HPIV3（100µmol／L）上下游引物各0.1 µL，HPIV1、HPIV2、HPIV3探针（100 µmol／L）各0.05 µL，RNase P上下游引物（50µmol／L）各0.06µL，RNase P探针（50µmol／L）各0.03 µL，模板15 µL，ddH2O 补至30 µL。反应条件：50 ℃20 min，95 ℃3 min；95 ℃15 s，54 ℃30 s，共45 个循环，每个循环退火时收集荧光信号。

将pUC57-HPIV1、pUC57-HPIV2、pUC57-HPIV3、pUC57-RNase P重组质粒标准品10 倍稀释后作为模板，经多重荧光定量RT-PCR 扩增，标准曲线方程分别为：y=-3.557x+47.153，R2=0.996 5，扩增效率（E）=91%；y=-3.385x+47.315，R2=0.995 2，E=96%；y= -3.495x+ 47.315，R2= 0.995 5，E= 97%；y=-3.306x+43.556，R2=0.993 4，E=112%。见图1。表明4 种质粒标准品在103~ 107copies／mL 范围内与Ct值呈良好的线性关系。

图1 pUC57-HPIV1（A）、pUC57-HPIV2（B）、pUC57-HPIV3（C）、pUC57-RNase P（D）重组质粒标准品的多重荧光定量RT-PCR标准曲线Fig.1 Standard curves of multiplex real-time RT-PCR assay for recombinant plasmid standards of pUC57-HPIV1（A），pUC57-HPIV2（B），pUC57-HPIV3（C）and pUC57-RNase P（D）

2.3方法的验证

2.3.1灵敏度 建立的多重荧光定量RT-PCR 方法对HPIV1、HPIV2 和HPIV3 的最低检测限均能达到500 copies／mL，见表2。

表2 灵敏度验证结果（x±SD，n=20）Tab.2 Results of sensitivity verification（x±SD，n=20）

2.3.2特异性 建立的多重荧光定量RT-PCR 方法仅对HPIV1、HPIV2、HPIV3核酸的扩增结果为阳性，见图2。表明该方法特异性较强。

图2 方法的特异性验证Fig.2 Verification for specificity

2.3.3精密度 3 种浓度的pUC57-HPIV1、pUC57-HPIV2、pUC57-HPIV3、pUC57-RNase P重组质粒标准品混合物多重荧光定量RT-PCR 检测结果的组内和组间CV均小于3%，见表3。表明该方法精密度较好。

表3 精密度验证结果（x±SD，n=3）Tab.3 Results of precision verification（x±SD，n=3）

2.4方法的初步应用192份临床样本中，检出HPIV1阳性15 份，阳性率7.81%；HPIV2 阳性1 份，阳性率0.05%；HPIV3 阳性6 份，阳性率3.1%。阳性样本测序结果与本方法检测结果一致。表明建立的方法可用于临床样本的检测。

3 讨论

HPIV是导致儿童下呼吸道感染的重要病原体［16-17］。其引起的主要疾病有咽扁桃体炎、支气管炎、肺炎、喉炎、肺炎等。不同亚型的HPIV 引起的临床疾病及临床表现不同，HPIV1、HPIV2是引起急性支气管、支气管肺炎的主要亚型，表现为鼻塞、肌痛、关节痛，较少有发热［18］。HPIV3是引起咽扁桃体炎、喉炎的主要亚型，表现为咳嗽、鼻炎等，多出现发热［19-20］。流感病毒和副流感病毒感染的诊断极为相似，难以区分。因此，建立一种能够快速准确区分HPIV 亚型的诊断方法对HPIV的临床治疗具有重要意义。

对于HPIV 的检测，传统方法如病原体分离培养鉴定，存在费事费力等缺陷，难以满足临床快速诊断的要求。而免疫学检测存在窗口期且灵敏度和特异性略低［21］。荧光定量RT-PCR 作为一种快速、灵敏、特异的检测方法，在临床实验室中得到了广泛应用，但其检测项目单一，无法满足临床诊断需求。多重荧光定量RT-PCR 法可在1 个反应体系中同时检测多个目的基因，具有简便、经济、高效等优点［22］。但多重荧光定量RT-PCR体系中存在多对引物和探针，会对扩增体系造成抑制作用或降低灵敏度，需要对引物和探针组合及反应体系进行优化。PCR 反应的内质控与样本同样参与检测全过程，实施对每一份样本的监控职责［23］。RNase P 是人体各组织器官细胞中普遍存在的一种酶，对于人源性样本的RNA 检测，RNase P可作为内质控使用。

本研究通过筛选特异性引物及探针，优化反应条件，建立了一种用于检测HPIV1、HPIV2、HPIV3的多重荧光定量RT-PCR方法，该方法特异性强，与甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒、新型冠状病毒无交叉反应，最低检测限为500 copies／mL；3种浓度的重组质粒标准品混合物的组间和组内CV均低于3%，精密度较好。本研究建立的多重荧光定量RT-PCR 方法可用于临床呼吸道感染患者的早期筛查，与传统检测方法相比，具有高灵敏度、高分辨、快速甄别等特点，不仅可有效提高临床检测效率，也能明确感染的病原体类型，为临床快速鉴别诊断HPIV 及其精准治疗提供了诊断结果和理论依据，对防治HPIV 感染和保护公共卫生安全具有重要意义。综上所述，本研究建立了HPIV1、HPIV2 和HPIV3 多重荧光定量RT-PCR 检测方法，可用于HPIV 感染及其亚型的鉴别诊断。