艰难梭菌疫苗临床试验的研究现状及挑战

陶薇，傅婷 综述，洪艳 审校

杭州医学院检验医学院、生物工程学院，浙江杭州310013

艰难梭菌（Clostridiodes difficile，C.difficile），即难辨梭状芽孢杆菌，是一种厌氧生长的革兰阳性梭状产毒芽孢杆菌，广泛分布于自然环境、动物和人的粪便中，其芽孢对高温、强酸、抗生素和辐射等均具有较强的抵抗力［1］。艰难梭菌是医院抗生素相关腹泻（antibiotic-associated diarrhea，ADD）的主要病因［2-3］。当个体肠道正常菌群平衡被抗生素破坏时，会造成艰难梭菌感染（C.difficileinfection，CDI）。艰难梭菌致病性菌株主要产生两种同源性糖基化毒素，艰难梭菌毒素A（C.difficiletoxin A，TcdA）和艰难梭菌毒素B（C.difficiletoxin B，TcdB），一些高致病菌株还会产生二元毒素（binary toxin），又称艰难梭菌转移酶（C.difficiletransferase，CDT），会造成从腹泻到高致死的中毒型巨结肠等症状［4-5］。自2003 年，由于艰难梭菌强毒力株核糖体型027（ribotype 027，RT027）的出现，CDI 的发病率、复发率及死亡率在全球范围内均大幅上升［6-7］。在北美、欧洲等国家均出现艰难梭菌高毒力株暴发流行。在欧洲，根据欧洲疾病预防和控制中心（EuropeanCentreforDiseasePreventionandControl，ECDC）对医疗保健相关感染的调查，2011—2012年期间，欧洲CDI 病例数为123 997 例［95%置信区间（confidence interval，CI）：61 018 ~ 284 857 例］［8-9］。自2016 年1 月，ECDC 开始收集欧洲急诊医院CDI发病率的监测数据。作为ECDC监测数据的一部分，来自20 个国家的556 家医院共报告了7 711 例CDI 病例［10］。而美国CDI 的感染率更高。美国疾病预防控制中心2019年抗生素耐药报告显示，美国2017年艰难梭菌感染病例数为223 900，其中15% ~ 35%的CDI患者有1次或多次反复感染，死亡病例数为12 800［11］。亚洲多数国家也出现了RT027 型菌株。2014 年，中国报道了首例RT027 型菌株的临床感染病例［7，12］。但目前RT027型菌株在亚洲国家并不常见［13］。鉴于CDI对患者、医疗机构和社会造成的巨大疾病负担，预防性疫苗的研发尤为重要。国内外对艰难梭菌疫苗的研究方案中，主要以TcdA和TcdB作为靶抗原［14-17］；此外还有TcdA、TcdB 和CDT 的联合疫苗研究方案，非产毒艰难梭菌肠道上皮定植和黏附，以及艰难梭菌鞭毛帽蛋白、表面多糖和脂磷壁酸等作为疫苗的候选方案［18-22］。迄今尚无获得使用许可的艰难梭菌疫苗，本文对艰难梭菌疫苗临床试验的研究现状和挑战作一综述。

目前已进入临床试验的候选疫苗主要为TcdA和TcdB 相关疫苗。TcdA 和TcdB 是艰难梭菌重要的致病物质。它们通过糖基化修饰引起结肠上皮细胞内Rho 蛋白家族鸟苷三磷酸酶（GTPases）失活，改变结肠上皮细胞结构和破坏上皮黏膜屏障，并诱发强烈的炎性反应［23-24］。既往研究表明，患者抗毒素抗体水平与CDI复发风险呈负相关［25］。因此，TcdA和TcdB被作为艰难梭菌主要的疫苗候选抗原。目前，赛诺菲巴斯德、辉瑞、Valneva、默克和Synthetic Biologics 5家药企均有TcdA 和TcdB 相关疫苗投入临床试验。此外其他疫苗方案的生物制品也投入临床试验，如Takeda／Shire和葛兰素史克。以下逐一对这些处于临床试验的艰难梭菌疫苗进行介绍（见表1）。

表1 艰难梭菌候选疫苗临床试验阶段研究现状Tab.1 Research status of C.difficile candidate vaccine in clinical trial stage

1 Cdiffense

Cdiffense 是赛诺菲巴斯德研制的一种二价类毒素疫苗。采用传统方法，从天然高毒素艰难梭菌菌株VP110463 中纯化TcdA 和TcdB，经甲醛处理脱去其毒性后，以氢氧化铝作为佐剂，制备二价类毒素疫苗。在已报道的临床Ⅱ期试验中（2011年6月—2013 年6月），40~64岁患者接种100µg二价类毒素疫苗，免疫3次（0、7和30 d）后，约90%检测出高效价中和抗体；老年患者（65~75岁）在第180天进行第4次免疫后，60%抗体阴性患者阳转，中和抗体阳性率增加至90%［26］；但临床Ⅲ期试验中期报告显示，该疫苗不能完成预防原发CDI的预期目标，终止在临床Ⅲ期试验［27］。

2 PF-06425090

与赛诺菲巴斯德二价类毒素疫苗Cdiffense 相比，辉瑞PF-06425090 疫苗采用基因工程技术构建TcdA和TcdB表达载体，并通过缺乏TcdA和TcdB基因的非孢子化艰难梭菌进行表达。该毒素同时采用基因修饰和化学法脱毒，以氢氧化铝作为佐剂［28］。2012年9月—2014年1月，192名50~85岁美国健康成人参与临床Ⅰ期试验。在第2次免疫后出现TcdA和TcdB 中和抗体，第7 个月产生预期浓度的TcdA和TcdB 中和抗体，类毒素组抗体滴度高于佐剂组。50~64与65~85岁组免疫效果相当。常见的不良反应为接种部位疼痛、头疼和疲劳［29］。2015 年7 月—2017 年3 月，对855 名年龄在65 ~ 85 岁之间的美国健康成人进行疫苗临床Ⅱ期试验，比较不同的接种剂量和不同免疫周期对TcdA 和TcdB 中和抗体的影响。临床Ⅱ期试验证明，该疫苗对65~85 岁健康美国成年人安全性、耐受性好，免疫原性强。200µg免疫剂量和月方案（0、1 和6 月）组产生的中和抗体效价更高［30］。2016 年2 月—2017 年2 月，该疫苗在日本进行临床Ⅰ期试验，也获得预期结果［31］。在临床Ⅲ期试验中（2017年3月—2021年12月），17 571名年龄≥50 岁健康成人参与，截至2022 年3 月1 日，基于次要终点，该疫苗在缩短病程和减轻疾病严重程度方面具有强大的潜在效应。

3 Bezlotoxumab

Bezlotoxumab 是由美国默克制药公司研发的人源化TcdB 单克隆抗体（MK-6072），用于预防艰难梭菌复发感染［32］，目前已经完成临床Ⅲ期试验［33］。近期，JOHNSON 等［34］研究发现，单独使用Bezlotoxumab或联合actoxumab（KM-3415）均能有效降低B1 型艰难梭菌的复发率和死亡率。

4 VLA84疫苗

与类毒素疫苗不同，Valneva Austria VLA84 疫苗是一种含有TcdA 和TcdB 受体结合域（receptor binding domain，RBD）的嵌合蛋白，该疫苗可在异源表达系统中制备，无需培养艰难梭菌。在临床Ⅰ期试验（2010 年12 月— 2013 年5 月）中，佐剂对疫苗免疫原性的影响无差异，抗体能够中和VPI10463 产生的2 种毒素的活性［35］。目前该疫苗已完成临床Ⅱ期试验。

5 SYN-004（Ribaxamase）

SYN-004（Ribaxamase）是Synthetic Biologics 研发的第二代口服药β-内酰胺酶，旨在降解排泄至胃肠道的静脉注射β-内酰胺类抗生素，从而保护肠道微生物群，预防原发性艰难梭菌感染和抗生素相关性腹泻。第一代口服药P1A，主要是一种青霉素酶，对头孢菌素无活性［36］。SYN-004（Ribaxamase）扩大了降解谱，包括头孢菌素。临床Ⅱ期试验发现，412 名诊断为下呼吸道感染而接受静脉注射头孢曲松的住院患者中，安慰剂组艰难梭菌感染率为3.4%，而SYN-004（Ribaxamase）组为1%，证明降解抗生素可预防艰难梭菌感染［37］。

6 VP 20621

并非所有艰难梭菌均产生毒素，缺乏产生毒素基因的非产毒素艰难梭菌（non-toxigenicC.difficile，NTCD）也存在于医院环境和住院患者中，患者通常无症状。既往研究表明，NTCD在患者和仓鼠的胃肠道定植后，可预防产毒菌株引起的CDI［38］。根据这一生物学特征，Takeda／Shire 研制了NTCD M3 菌株（NTCD-M3）孢子疫苗VP 20621。该疫苗目前已完成临床Ⅱ期试验。经甲硝唑或万古霉素治疗后的CDI患者口服VP 20621 疫苗后，NTCD-M3 肠道定殖率为69%，其中NTCD-M3 肠道定殖成功的86 例中仅2 例（2%）复发CDI，而NTCD-M3肠道定殖不成功的39例患者中12例（31%）复发CDI。表明NTCD-M3定植肠道，占据肠道的生存环境，可有效阻止致病艰难梭菌定植，显著减少CDI复发［39］。

7 GSK2904545A

葛兰素史克研制的一种含有艰难梭菌F2 抗原GSK2904545A（疫苗方案未公布）在2019 年8 月进入临床Ⅰ期试验，目前尚未结束临床Ⅰ期试验。

8 挑战

对艰难梭菌疫苗的研究已超过20 年，但目前仍无许可的人用疫苗。尽管艰难梭菌类毒素疫苗可中和毒素，预防毒素引发的肠道症状，但具有局限性。既往研究表明，类毒素疫苗不能防止艰难梭菌在胃肠道定殖［40］。此外，也不能阻止艰难梭菌产孢子，因此可能增加无症状感染者的数量［41］。含有RBD 嵌合蛋白疫苗VLA84 具有1 个明显的缺陷，即缺乏位于毒素其他部位的中和抗原表位。此外，一些艰难梭菌菌株的变异，可能限制了该疫苗的有效免疫能力。在艰难梭菌毒素单克隆抗体Bezlotoxumab 的临床Ⅲ期试验中显著降低了复发／继发性CDI 的风险［33］，预示着一个良好的研究方向，但同时也提出了一些问题：如何时接种该疫苗、如何在CDI 治疗中发挥作用等，均需进一步探讨。鉴于目前正在进行临床试验的候选疫苗的试验范围，在未来5 年内获得许可的艰难梭菌疫苗是可行的。但由于赛诺菲巴斯德类毒素疫苗Cdiffense 在临床Ⅲ期试验中的失败，提醒研发者需考虑改进现有疫苗方案。