两性霉素B 脂质体局部毒性研究

方云涛，蔡正清，邵卿

江苏省药物研究所有限公司，江苏 南京 210000

两性霉素B 是一种大环内酯乳糖多烯类抗生素，它主要作用机理是通过与真菌细胞膜上的麦角固醇相互结合，破坏真菌细胞膜的通透性，使得胞内物质如钾离子、氨基酸、核苷酸等外漏，影响其正常代谢从而达到抑制真菌的生长和繁殖，对绝大部分真菌（如念珠菌、隐球菌、霉菌）均有很大的杀伤作用，抗菌疗效很好，且很少有耐药菌株的发现，是临床上用于治疗侵入性真菌疾病的一线药物［1-4］。两性霉素B 脱氧胆酸盐为两性霉素B 传统使用剂型，临床应用最久，但是临床应用中会出现肾脏损伤、肝脏损伤和静脉注射不良反应，使其在临床上的使用受到限制［5-6］。20 世纪90 年代出现了两性霉素B 的新剂型——脂质体两性霉素B，与传统使用剂型相比其显示出巨大的优势，由于其包裹脂质体通过增强对细胞膜麦角固醇的亲和力，提高了两性霉素B 的抗菌能力，还能通过控制和减慢两性霉素在身体组织中的扩散速度，显著降低由于两性霉素B 的使用而引起的肝脏、肾脏的损伤和静脉输液产生的相关反应的发生率，使得两性霉素的足量应用成为可能。目前对两性霉素脂质体的研究主要集中于两性霉素B 脂质体（Lipo-AB）的制备、药效、对真菌感染引起疾病的疗效及不良反应等方面，对其用药安全性缺乏系统性的评价。因此，本研究从溶血性，过敏性及刺激性等方面开展试验［7-9］，对其安全性评价进行补充，为临床合理用药提供参考。

1 材料

1.1 实验动物

实验兔4 只(普通级)，购于南京市江宁区青龙山动物繁殖场(合格证编号：0018790)；豚鼠（SPF级）24 只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司(合格证编号：0292746)；BALB/c 小鼠（SPF 级）24 只，购于北京维通利华实验动物技术有限公司(合格证编号：0292746)。饲养于江苏省药物安全评价中心动物房中，且本研究实验经过江苏省药物研究所有限公司伦理委员会批准。

1.2 主要仪器与试剂

BS124S 电子天平（梅特勒-托利多），组织包埋机（天津爱华），RM2245 切片机（德国徕卡公司），ASP200 真空脱水机（德国徕卡公司），ST4040 染色机（德国徕卡公司），光学显微镜（奥林巴斯）。

两性霉素B 脂质体（Lipo-AB）（来源：江苏省药物安全评价中心供试品室，批号：040211040500，规格：50 mg/ 瓶）；阳性对照品卵白蛋白（egg almumin）（来源：SunShine，批号：0E200E20）；伊文思蓝（来源：国药集团化学试剂有限公司，批号：WC20091209）；5%葡萄糖注射液（来源：南京小营药业集团有限公司，批号：2012042003，规格：100 mL∶5 g）。

2 方法

2.1 Lipo-AB 配置

临床用法：取Lipo-AB 1 瓶（50 mg），用12 mL 无菌注射用水溶解，浓度为4 mg/mL，用5%葡萄糖注射液稀释为浓度为2 mg/mL 的溶液，作为供试品。依据《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》［7］要求，以下局部毒性试验均采用的受试物浓度为2 mg/mL（临床最大浓度）。

2.2 实验方法

参照《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》［7］进行血管刺激性实验、体外溶血实验、主动全身过敏和被动皮肤过敏实验。

2.2.1 血管刺激性试验普通级实验兔3 只，左耳静脉给予Lipo-AB，右耳给予等体积溶剂（5%葡萄糖注射液）作为对照，Lipo-AB 的使用剂量为10 mg/kg，为人用最大剂量的1.67 倍。给药频率：1 次/d，持续3 d；给药容积为5 mL/kg；给药速度为3 mL/min。每次给药前后以及末次给药后（24 h、48 h）观察给药部位的刺激性反应，末次给药48 h后取注射部位（近心端血管）做组织病理学检查。

2.2.2 体外溶血试验成年实验兔心脏采血10 mL，用玻璃珠去纤维蛋白，清洗，离心后，用葡萄糖注射液配置为2%混悬液备用。随后取7 支试管，各个试管加样如表1 所示，混匀，置于37 ℃恒温箱中，在15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、3 h 时间点观察溶血现象。

表1 Lipo-AB溶血试验加样表 mL

2.2.3 主动全身过敏试验豚鼠24 只，按体重随机分组为高剂量组，低剂量组，阴性对照组和阳性对照组（卵白蛋白），每组各6 只。致敏阶段，隔日腹腔给药3 次，各组分别给予高剂量Lipo-AB（6.67 mg/kg），低剂量Lipo-AB（3.33 mg/kg），5%葡萄糖注射液和卵白蛋白（10 mg/mL），给药容积为0.5 mL/300 g。末次致敏后第14 天，各组静脉给予高剂量、低剂量、5%葡萄糖注射液及10 mg/mL 卵白蛋白2 mL/300 g 进行攻击，给药容积为2 mL/300 g。观察过敏症状，参考表2、表3 进行结果判定。

表2 过敏反应症状

表3 全身致敏性评价标准

2.2.4 被动皮肤过敏试验24 只BALB/C 小鼠分四组，高、低、阳性对照组、阴性对照组，每组6只，雌雄各半，分别腹腔给予高剂量Lipo-AB（20 mg/kg），低剂量Lipo-AB（6 mg/kg）、阳性对照品（卵白蛋白，5 mg/20g）与阴性对照（5%葡萄糖注射液），以2%氢氧化铝凝胶为佐剂。给药容积均为0.2 mL/20 g，隔日一次，共3 次。14 d 后取血制备抗血清。大鼠被动皮肤过敏试验使用24 只SD 大鼠，雌雄各半，按体重分为4 组。背部脊柱两侧1.5 cm处各选取2 个点，间隔1.5 cm～2 cm，皮内注射1∶2、1∶4、1∶8 和1∶16 的抗血清，0.1 mL/点，24 h后抗原激发，受试物组静脉分别给予高剂量和等体积的0.5%伊文思蓝混合液2 mL/200 g、低剂量和等体积0.5%伊文思蓝混合液2 mL/200 g，阴性对照组给予5%葡萄糖注射液和等体积0.5%伊文思蓝混合液2 mL/200 g；阳性对照组给予卵白蛋白和等体积0.5%伊文思蓝混合液2 mL/200 g。30 min后取皮肤测定内侧蓝斑直径，判定实验结果（直径值大于5 mm 者结果为阳性）。

3 结果

3.1 血管刺激性试验

实验期间，各组动物肉眼观察无异常，耳部血管也未发现刺激性症状，如红斑、水肿等。与组织病理学检查结果相一致，病理结果显示各例兔耳各层组织正常，血管管壁完整无扩张和充血现象，血管内皮细胞无肿胀、坏死、脱落，管腔内无血栓，管周无水肿、出血和炎细胞浸润（见图1）。

图1 Lipo-AB血管刺激实验病理检查（HE×200）：A.对照组T0401号血管近段；B.对照组T0401号血管中段；C.对照组T0401号血管远段；D.给药组T0403号血管近段；E.给药组T0403号血管中段；F.给药组T0401号血管远段

3.2 体外溶血实验

在2 mg/mL 浓度下，供试品Lipo-AB 溶血试验结果为：在15 min 观察点，1-6 号管凹液面处红细胞下沉，可见一透明圆环，未见溶血现象，阳性对照管（7 号）呈透明红色，出现溶血现象；在30 min观察到1-6 号管中红细胞继续下沉，未见溶血现象，阳性对照管溶血，试管底部未出现下沉红细胞；在第45 分钟、第1 小时、第2 小时、第3 小时观察结果同30 min。3 h 观察时间结束后拍照（结果见图2），振摇试管，1 号到6 号管管底红细胞均能均匀分散，均无红细胞凝集现象。

3.3 主动全身过敏试验

致敏期间，供试品高、低剂量组豚鼠体重下降，可能原因为腹腔注射抗菌素类药物后，引起肠道正常菌群紊乱，导致豚鼠出现体重减轻，消瘦。各供试品组和阴性对照组激发后均未观察到任何过敏症状，过敏反应结果为阴性；阳性对照组动物激发约5 s开始观察到瘙痒、抽搐、大小便失禁等症状，所有动物在1 min 内死亡，过敏反应评级为极强阳性，过敏反应发生率为100%。

3.4 被动皮肤过敏试验

抗原激发30 min 处死动物，测定蓝斑直径，结果显示：阴性对照、供试品低、高剂量结果均小于5 mm，结果为阴性。阳性对照组大鼠背部各个注射部位蓝斑直径均大于5 mm，1∶2、1∶4、1∶8、1∶16 稀释点蓝斑直径均值为17.2 mm、13.0 mm、11.8 mm、11.0 mm，被动皮肤过敏反应出现阳性反应的最大稀释倍数为1∶16（结果见表4 和图3）。

图3 主动全身过敏试验蓝斑

表4 Lipo-AB大鼠被动皮肤过敏试验结果（）mm

表4 Lipo-AB大鼠被动皮肤过敏试验结果（）mm

4 讨论

真菌感染通常是由于偶然接触到真菌所致，若受感染患者免疫力低下，真菌即可在身体中存活、繁殖，随即致病，对某些患者来说可能会危及生命。目前由于HIV 感染、化疗、器官移植、免疫抑制剂等治疗手段导致免疫力低下人群的增加，以及老龄患者比例增加等一些原因，使得侵袭性真菌感染成为临床最常见的机会性感染疾病，对免疫力低下的重症、老龄、儿科患者产生巨大威胁［10-11］。

两性霉素B 作为一种多烯类广谱抗生素，被广泛应用于抗真菌感染，具有很高的临床价值。两性霉素是作用最强、抗菌谱最广的抗真菌药物之一，可以有效治疗侵袭性念珠菌病、曲霉病、新生隐球菌病、毛霉病、组织胞浆菌病、马尔尼菲篮状菌病等深部真菌感染，并且其不通过P450 代谢，与其他药物相互作用较少，不影响其他药物的疗效［12-13］。但是治疗过程中会产生如低钾血症、肝肾功能受损、白细胞减少、心悸、低血压、恶心呕吐等副作用，限制了其在临床上的使用［14-15］。此种情况促使Lipo-AB 这一剂型的出现，有研究显示Lipo-AB稳定的类脂质双分子层结构减少了其对红细胞的溶解毒性，且体内实验也显示出其相对于市售注射用制剂更好的耐受性［16］。同时也有多项研究证实应用Lipo-AB 对患者进行抗真菌治疗，其肾毒性、输液相关不良反应的发生率均低于普通注射制剂，并使得真菌感染患者获得更好的治疗效果［17-18］。

尽管Lipo-AB 在保留两性霉素B 的有效抗真菌能力外，改善了与其相关的肾毒性等不良反应，但是Lipo-AB的抗真菌机制目前尚不完全明确，脂质体药物体内结合释放情况受什么因素影响，对不同真菌的药物活性，可能产生的其他毒副反应、刺激性、过敏性和溶血性局部毒性及可逆性等等问题需要继续研究明确。

本研究根据《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》［7］以及《药品注册管理办法》［8］的相关要求，采用了供试品Lipo-AB 临床最大浓度（2 mg/mL）进行了刺激性、过敏性与溶血实验，结果显示：2 mg/mL Lipo-AB 对兔耳血管无刺激性作用；溶血试验未见溶血或/和红细胞凝集现象；在6.67 mg/kg 及3.33 mg/kg 剂量下，豚鼠全身主动过敏试验结果为阴性；Lipo-AB 被动皮肤过敏反应结果均为阴性，提示在此浓度或剂量下，Lipo-AB 并未显示出明显的局部毒性，是安全的。