基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS 技术的血平片化学成分及指纹图谱的研究

梁国嫔，周朝忠，康兴东，李晶，夏淑英，李小锋

1.江西省药品检查员中心，江西 南昌 330029；2.江西普正制药股份有限公司，江西 吉安 343100

血平片处方中包括地黄、三七、海螵蛸、熟大黄、茜草、地榆和炒蒲黄等药材，具有清热化瘀、止血调经的功效。血平片在临床上常用于治疗因挟瘀所致的崩漏［1］。目前血平片的质量控制主要以大黄和三七的含量测定为主，缺少对血平片整体的质量控制［2］。中药及其制剂成分极其复杂且多样，对中药质量评价难度也较大。目前超高效液相色谱-四级杆静电场轨道阱质谱（UHPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS）技术在中药的化学成分分析方面有着快速、高效等特点被广泛应用于中药的物质基础研究，而中药指纹图谱技术可在中药化学成分研究的基础上提供丰富的信息，进而整体地评价中药制剂的质量［3-5］。

血平片处方中的三七含有的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1［6-7］以及地榆中含有的地榆皂苷-Ⅱ［8］等成分多为紫外末端吸收的成分，仅使用紫外检测器无法检测出这些成分。蒸发光散射检测器广泛用于无紫外吸收或末端吸收的有机物质，如人参皂苷、黄芪甲苷等，是一种通用型检测器。因此本研究基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS 技术和对照品比对鉴定血平片主要成分的基础上，采用高效液相色谱法联合紫外检测器（HPLC-UV）与蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）建立方便可行的指纹图谱方法，为血平片的质量控制提供客观有效的评价方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters 2695-2996-ELSD 液相色谱仪（美国Waters 公 司）；Ultimate 3000 超 高效液相色谱系统-Q-Exactive Orbitrap-MS 高分辨液质联用谱仪（美国赛默飞世尔科技公司）；岛津LC20A-ELSD 液相色谱仪（日本岛津公司）；BSA124S-CW 电子分析天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；9960D 超声波清洗仪（CBL 科贝尔）；Mili-Q 超纯水仪（美国Millipore 公司）。

1.2 材料

毛蕊花糖苷、大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、地榆皂苷-Ⅱ、香蒲新苷对照品均购于中国食品药品检定研究院（批号分别为111530-201914、110756-201913、110795-201710、110757-201607、110796-201922、110758-201817、110745-201921、110703-201933、110704-202028、111952-201301、111573-201806）；13 批血平片样品均由江西普正制药股份有限公司生产和提供；甲醇、乙腈、甲酸均为色谱纯；水为自制超纯水。

2 方法

2.1 对照品溶液的制备

分别称取大黄素、毛蕊花糖苷、芦荟大黄素、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、大黄酸、人参皂苷Rb1、大黄酚、地榆皂苷-Ⅱ、大黄素甲醚、香蒲新苷适量，置25 mL 量瓶中，加甲醇溶解后定容至刻度，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2 供试品溶液的制备

取血平片20 片，除去薄膜衣，精密称定，研细，取粉末约2 g，精密称定，精密加入70%甲醇25 mL，称定重量，加热回流2 h，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 液相色谱-质谱联用条件

2.3.1 色谱条件采用XBridge BEH C18 色谱柱（2.1 mm×150 mm，2.5 μm），以0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱（0～20 min，5%→95%B；20～45 min，95%B；45～60 min，95%→5%B），流速0.3 mL/min，柱温40 ℃，进样量5 μL。

2.3.2 质谱条件使用赛默飞HPLC-Q-Exactive Orbitrap-MS 高分辨液质联用仪进行样品检测。仪器校正后误差<5 ppm，电喷雾离子源采用正、负离子模式进行数据采集。以普通氮气为辅助气和鞘气，高纯氮为碰撞气。采用Full MS/dd-MS2（Top3）正负切换同时采集，触发前三强母离子的二级扫描，碰撞能量NCE 设置为：20、40、60；扫描范围：150～1 500；裂解电压：3.2 kV；鞘气：40 psi；辅助气流量：10 arb ；离子传输管温度：320 ℃；一级质谱分辨率：70 000FWHM ；二级质谱分辨率：17 500FWHM。数据采集软件采用Xcalibur2.1。

2.4 指纹图谱色谱条件

采用ODS C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以0.1%甲酸溶液（A）-甲醇（B）为流动相，梯度洗脱（0～5 min，20% B；5～45 min，20%→48%B ；45～60 min，48% →61% B ；60～90 min，61%→98% B）；柱温30 ℃；流速为1.0 mL/min，检测波长为254 nm；ELSD 温度60 ℃；氮气压力350 kPa；增益值6/32 倍。

3 结果

3.1 血平片的主要成分分析

在拟定的分析条件下，血平片在正、负离子模式下的总离子流图见图1。根据得到的高分辨质谱提供的一级准分子离子峰和二级质谱碎片离子峰的精确m/z 信息，确证了有关物质及特征碎片的化合物结构信息。通过已有的数据库和对照品的相关的文献［6-18］资料，共鉴定或推断41 种主要化学成分，鉴定结果见表1。初步阐明了血平片的物质基础信息，为建立信息量丰富的血平片指纹图谱提供便利。

图2 13批血平片HPLC指纹图谱共有模式（UV 254 nm）

表1 血平片中主要化学成分鉴定

3.2 指纹图谱的建立与分析

3.2.1 指纹图谱的建立及相似度评价取13 批次血平片样品，按“2.2”项下方法分别制备供试品溶液，进样测定，将所得图谱导入“评价系统”进行计算，得到13 批样品的相似度值，见表2。样品相似度范围为0.903～0.990，说明13 批血平片的批间质量稳定性良好。13 批样品HPLC 指纹图谱共有模式图见2、图3，生成的对照指纹图谱见图4、图5。

图4 血平片对照指纹图谱（UV 254 nm）

图5 血平片对照指纹图谱（UV 254 nm）

表2 不同批次血平片HPLC指纹图谱相似度

3.2.2 精密度试验按“2.2”项下方法制备血平片（批号150902）供试品溶液，连续进样6 次，将所得图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）”（以下简称“评价系统”），结果其相似度均在0.98 以上。并且在UV、ELSD 条件下分别以17、23 号特征峰为参照峰，各特征峰相对保留时间RSD值分别为0.11%、0.17%，相对峰面积RSD 值分别为1.83%、1.20 %，表明该方法精密度良好。

3.2.3 重复性试验按“2.2”项下方法平行制备6份血平片（批号150902）供试品溶液，分别测定，将所得图谱导入“评价系统”，结果相似度均在0.95以上。在UV、ELSD 条件下以17、23 号特征峰为参照峰，各特征峰相对保留时间RSD 值分别为1.18%、0.10%，相对峰面积RSD 值分别为1.66%、0.38%，表明该方法重复性良好。

3.2.4 稳定性试验取“3.2.1”项下供试品溶液分别于0、2、4、8、12、24 h 测定，将所得图谱导入“评价系统”，结果相似度均在0.98 以上。在UV、ELSD 条件下以17、23 号特征峰为参照峰，各特征峰相对保留时间RSD 值分别为0.13%、0.08%，相对峰面积RSD 值分别为2.14%、0.81%，表明该供试品在24 h 内稳定。

4 讨论

本研究首次采用 UHPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS 技术对血平片的化学成分定性分析，基于分析结果对指纹图谱起到了指导作用。指纹图谱同时采用HPLC-UV 和HPLC-ELSD 全面对血平片特征峰信息表征，从整体性方面体现了独特的优势［3］。该技术具有快速、高效地对中药的化学成分进行定性分析的优势，指纹图谱能够全面地反映中药的整体质量。采用高分辨质谱技术结合指纹图谱技术对血平片的物质基础进行研究，与现有的血平片等含三七制剂的质量控制方法［1-2］相比，能显示更多的特征峰信息，能有效地表征其质量，也为血平片后续的质量控制与药效研究提供了物质信息基础。

在血平片指纹图谱的建立方面考察了提取溶剂、提取方式等因素，筛选出最佳制备方法，最终采用以70%甲醇加热回流2 h 的提取方法。

本研究建立的指纹图谱进行了精密度、重复性、稳定性试验，确定了方法的可行性；通过对共有峰的确认与各药材相关联，方便对处方中大部分药材进行鉴别，但其中海螵蛸中的成分信息在血平片中展现较少，可能是因为物质特性、提取方式等原因导致。

本研究应用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap/MS 技术对血平片的主要化学成分进行分析鉴定，对血平片药效物质基础的阐明提供了重要依据，但其作用机制仍需进一步研究和验证。