HPLC-ELSD法和UPLC-MS/MS法评价石斛夜光丸中人参投料掺伪情况

朱韬，何颂华，李丽莉，罗轶（广西壮族自治区食品药品检验所 国家药品监督管理局中药材质量监测与评价重点实验室，南宁 530021）

石斛夜光丸是治疗眼疾的古老传统名方，处方由石斛、人参、山药、茯苓、地黄、天冬、山羊角等25味中药组成，现收载于《中国药典》2020 年版，具有滋阴补肾、清肝明目的功效[1]。现代临床研究表明，石斛夜光丸用于治疗干眼症、玻璃体混浊、中心性浆液性脉络膜视网膜病变、慢性葡萄膜炎、青光眼术后、溢泪症、肝肾阴亏型足跟痛、冠心病及心肌梗死等疾病[2-4]。处方中人参为伞形目五加科人参属植物人参（PanaxginsengC.A.Mey）的干燥根和根茎，性温，具有大补元气、固脱生津、安神益智等功效；西洋参为伞形目五加科人参属植物西洋参（PanaxquinquefoliumL.）的干燥根，性凉，具有补气养阴、清热生津的功效，两者药效区别较大，不能混用。

随着市场需求不断提升，商家追求高额利润，近年来不断有报道使用西洋参混入中药制剂冒充人参进行投料生产[5-6]。2020年版《中国药典》中对于石斛夜光丸的人参质量控制仅涉及人参皂苷Rg1和人参皂苷Re两个成分，但西洋参中也含有这两种成分[7-8]，单纯采用这两个指标成分进行定性鉴别，对于是否存在西洋参掺伪投料情况无法评判。两味药所含化学成分极为相似，均以人参皂苷为重要活性成分，但所含皂苷种类与比例存在一定差异，如西洋参特有的拟人参皂苷F11，人参中基本没有[5，9]。因此本试验以拟人参皂苷F11为特征标志物，进行掺伪检查的方法研究。由于拟人参皂苷F11没有紫外吸收，本试验采用了高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）法，同时通过UPLC-MS/MS技术建立专属性强的检查方法，并对收集到的91批样品进行测试，以期对不同生产企业的产品进行评价，为石斛夜光丸中人参掺伪投料检测和质量标准完善提供参考。

1 仪器与材料

Agilent 1260高效液相色谱仪、Agilent 6460超高效液相色谱-质谱联用仪（Agilent公司），ELSD 6000蒸发光检测器（Alltech公司）；XP205电子天平（Mettler Toledo 公司，精度0.01 mg）；Milli-Q纯水仪（Millipore公司）。

人参（批号：120917-201712）、西洋参（批号：120997-201810）、拟人参皂苷F11（批号：110841-201607）（中国食品药品检定研究院），25批不同产地的西洋参和13批西洋参须均购自市场（经广西壮族自治区食品药品检验所黄清泉主管中药师鉴定为五加科植物西洋参PanaxquinquefoliumL.的干燥根和干燥根须），91批不同厂家、不同批次石斛夜光丸均为2020年国家药品评价性抽验样品。乙腈为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 HPLC-ELSD法

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Capcell PAK C18 MGIII（S-5）（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：以乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度洗脱（0～20 min：10%→30%A；20～45 min：30%A）；流速1.0 mL·min-1；柱温30℃；检测器ELSD，漂移管温度105℃，载气为氮气，气体流速3.0 L·min-1，增益1。

2.1.2 溶液的制备

① 对照品溶液：取拟人参皂苷F11（经标定，含量为99.9%）适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含100 μg的溶液，即得。

② 供试品溶液：取本品，研碎，取6 g，精密称定；置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇溶液100 mL，密塞，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用70%甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取滤液50 mL，置蒸发皿中，蒸干，残渣加水25 mL使溶解，加水饱和正丁醇振摇提取4次，每次25 mL，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤2次，每次50 mL，再用正丁醇饱和水50 mL洗涤，分取正丁醇液，减压浓缩，回收溶剂至干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

③ 阴性样品溶液的制备：按规定的处方量及工艺自制缺人参的石斛夜光丸阴性样品，按②项下方法制成阴性样品溶液。

④ 阳性样品溶液的制备：取阴性样品6 g 和西洋参3.4 mg（相当于6 g 制剂中10%人参的处方量），作为阳性样品，按②项下方法制成阳性样品溶液。

⑤ 人参供试品溶液的制备：取人参34 mg（相当于6 g制剂中人参的处方量），按②项下方法制成西洋参（须）供试品溶液。

⑥ 西洋参（须）供试品溶液的制备：分别取西洋参和西洋参须各3.4 mg，按②项下方法制成西洋参（须）供试品溶液。

⑦ 掺伪5%西洋参（须）样品溶液的制备：取阴性样品6 g 和西洋参（须）1.7 mg（相当于6 g 制剂中5%人参的处方量），作为阳性样品，按②项下方法制成掺伪样品溶液。

2.1.3 含量测定 分别精密吸取对照品溶液5 μL、20 μL及供试品溶液10 μL，进样测定，用外标两点法对数方程计算拟人参皂苷F11的含量。

2.1.4 专属性试验 分别吸取对照品溶液、阴性样品溶液和对照药材溶液各10 μL，进样测定。结果西洋参和西洋参须在拟人参皂苷F11峰相应位置显示有对应色谱峰，阴性样品和人参在拟人参皂苷F11相应位置无色谱峰，表明本方法专属性较好，色谱图见图1。

图1 HPLC-ELSD法专属性试验色谱图Fig 1 HPLC-ELSD diagram of specific test

2.1.5 线性关系考察 称取拟人参皂苷F11对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为0.0528、0.1055、0.3165、0.5275、1.0550 mg·mL-1的对照品溶液，进样测定。以对照品进样量为横坐标（X），峰面积对数值为纵坐标（Y）绘制标准曲线，计算回归方程为：Y＝1.650X+2.315，r＝0.9999。结果表明，拟人参皂苷F11在进样量为0.528～10.550 μg内与峰面积对数值线性关系良好。

2.1.6 耐用性试验 考察3种不同品牌色谱柱[CAPCELL PAK C18 MGIII（S-5）（5 μm，4.6 mm×250 mm）、Agilent 5TC-C18（2）（5 μm，4.6 mm×250 mm）、菲罗门SuperLu C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）]，结果3种色谱柱测定人参皂苷F11的峰面积RSD为0.79%，表明方法耐用性良好。

2.1.7 精密度试验 精密吸取拟人参皂苷F11对照品溶液，连续测定6次，结果峰面积的RSD为1.1%，表明本法的仪器精密度较好。

2.1.8 重复性试验 取同一批石斛夜光丸供试品（阳性样品），平行称取6份，按“2.1.2”项下方法制成相应溶液并测定，结果拟人参皂苷F11平均含量为149 μg·g-1，RSD为0.81%，表明本方法重复性较好。

2.1.9 稳定性试验 取同一批石斛夜光丸供试品（阳性样品），按“2.1.2”项下方法的色谱条件，每隔4 h测定一次，共测定6次，结果拟人参皂苷F11峰面积的RSD为1.4%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.1.10 加样回收试验 取阳性供试品6 g，精密称定，精密加入拟人参皂苷F11对照品溶液（2.4 mg·L-1）100 mL，按“2.1.2”项下方法制成相应溶液并测定，结果加样回收率为98.7%～104.4%，RSD为2.2%。

2.1.11 定量限和检测限 精密吸取拟拟人参皂苷F11对照品溶液（1.1 mg·mL-1），逐级稀释，进样测定，S/N为3∶1时确定检测限，S/N为10∶1时确定定量限，结果拟人参皂苷F11的定量限、检测限分别为13 μg·g-1、5.8 μg·g-1。

2.1.12 限度拟订 按照2020版《中国药典》四部0212药材和饮片检定通则规定杂质通常不得过3%[10]；中药成方制剂中人参与西洋参显微鉴别较困难，故放宽限度，以掺伪5%西洋参（须）样品中拟人参皂苷F11的含量平均值为限度。

2.1.13 掺伪样品测定 38份掺伪样品中拟人参皂苷F11的含量平均值为40 μg·g-1，拟订限度为石斛夜光丸每1 g含拟人参皂苷F11不得过40 μg。

2.2 UPLC-MS/MS法

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent Eclipse C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流动相：以0.1%甲酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，梯度洗脱，0～6 min：90%A；6～20 min：90%→50%A；流速：0.25 mL·min-1；柱温：30℃，进样量：1 μL。

2.2.2 质谱条件 采用电喷雾电离源，负离子方式扫描，MRM 模式检测；干燥气温度：350℃；干燥气流速：5 L·min-1；雾化气压力：40 psi；鞘流气温度：350℃；鞘流气流速：10 L·min-1；毛细管电压：3 kV；喷嘴电压：500 V；选择m/z845.5→653.4和m/z845.5→490.9作为检测离子对。

2.2.3 溶液的制备

① 对照品溶液：取拟人参皂苷F11对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含2 μg的混合溶液，即得。

② 供试品溶液：精密吸取“2.1.2”项下供试品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，微孔滤膜（0.22 μm）滤过，即得。

2.2.4 专属性试验 分别取“2.1.2”项下溶液，精密稀释10倍，进样测定。结果阴性样品和人参色谱中，均未出现与拟人参皂苷F11对照品色谱保留时间相同的色谱峰，表明处方中其他药味对该测定方法无干扰，见图2。

图2 UPLC-MS/MS法专属性试验色谱图Fig 2 UPLC-MS/MS chromatogram of specific test

2.2.5 线性关系考察 精密量取“2.1.2”项下对照品溶液0.05、0.1、0.2、0.4、1、2 mL，分别置10 mL量瓶中，用甲醇稀释并定容，摇匀，进样测定。以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线，得回归方程为：Y＝3.92×104X+3.04×103，r＝0.9998，在0.51～20 μg·mL-1内与峰面积线性关系良好。

2.2.6 耐用性试验 选取Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 µm）、Agilent Eclipse C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Waters CORTECS C18（2.1 mm×100 mm，2.7 µm）3种色谱柱，对检出西洋参掺伪的阳性样品进样分析，结果3种色谱柱的分析结果一致，拟人参皂苷F11的峰面积RSD为2.0%，表明方法耐用性良好。

2.2.7 精密度试验 取拟人参皂苷F11对照品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件，连续进样6次，测得峰面积的RSD为1.9%，表明该仪器精密度良好。

2.2.8 重复性试验 取“2.1.8”项下供试品溶液，稀释10倍，进样测定，结果色谱峰面积的RSD为1.7%，结果表明本法重复性较好。

2.2.9 稳定性试验 取“2.1.9”项下供试品溶液，稀释10倍，每隔4 h测定一次，共测定6次，结果拟人参皂苷F11峰面积RSD为1.2%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.2.10 加样回收试验 取阳性供试品6 g，精密称定，精密加入拟人参皂苷F11对照品溶液（2.51 mg·L-1）100 mL，按“2.2.3”项下方法制成相应溶液并测定，结果加样回收率为98.03%～106.07%，RSD为3.2%。

2.2.11 检测限和定量限 取未检出的空白样品制备空白基质溶液，精密加入拟人参皂苷F11对照品（80 μg·mL-1）0.1 mL，按“2.2.3”项下方法制备，进样分析，按信噪比S/N≈3折算，拟人参皂苷F11的检测限为0.6 μg·g-1；按S/N≈10折算，拟人参皂苷F11的定量限为1.9 μg·g-1。

2.2.12 限度拟订 不同西洋参和西洋参须制成的掺伪样品，拟人参皂苷F11的峰面积差异较大，因此以5%西洋参掺伪样品的平均峰面积为拟订限度的参考。

2.2.13 掺伪样品测定 38份掺伪样品的拟人参皂苷F11峰面积平均值为87 398.79，对应对照品的质量浓度为2 μg·mL-1。

2.2.14 判定原则 以拟人参皂苷F11对照品质量浓度（2 μg·mL-1）为判定限度，规定结果判断标准为：以m/z845.5→653.4和m/z845.5→490.9提取的供试品离子流色谱中，应不得同时出现拟人参皂苷F11保留时间一致的色谱峰；若同时出现，则供试品色谱中m/z845.5→653.4的色谱峰面积值应不得大于对照品溶液中相应的峰面积值。

3 样品含量测定

对91批石斛夜光丸进行检测，采用HPLCELSD法，结果35批样品拟人参皂苷F11含量超出拟订限度；采用UPLC-MS/MS法检测，结果35批样品拟人参皂苷F11质量浓度大于2 μg·mL-1。结果见表1。

表1 石斛夜光丸中拟人参皂苷F11的含量Tab 1 Content of pseudoginsenoside F11 in Shihu Yeguang pills

4 讨论

4.1 检测方法的选择

本试验对拟人参皂苷F11的提取方法进行了优化，考察了溶剂回流法和超声提取法，比较了不同溶剂提取（甲醇、70%甲醇、50%甲醇）、不同溶剂用量（50、100、150 mL）、不同提取时间（45、60、90 min）、洗涤次数对提取的影响，最终选择了本研究的提取方法。

人参与西洋参的区分方法有薄层色谱和性状鉴别[11]。本研究前期对薄层色谱方法进行了探索，由于薄层色谱灵敏度低，处方中药味较多，干扰斑点影响严重，不适用于石斛夜光丸中西洋参的检查。人参在石斛夜光丸中为原粉入药，因此不能通过性状进行鉴别。ELSD作为通用型检测器，可快速完成对无紫外吸收化学成分的定性与定量分析，HPLC-ELSD法减少中药制剂中紫外吸收强的成分的干扰，特别适用于测定皂苷类成分含量[12-14]。本研究使用的两种检测方法，UPLC-MS/MS法专属性强，分析时间短，而HPLC-ELSD法简便，仪器检测成本比较低，均适用于石斛夜光丸中拟人参皂苷F11的检测。

4.2 拟人参皂苷F11的裂解途径

拟人参皂苷F11为皂苷类化合物，质谱裂解中主要丢失母核上连接的糖苷碎片，负离子模式下质谱响应较好，显示较强的[M+HCOO]-m/z845.5的准分子离子峰，母离子峰为m/z799.6 [MH]-，先脱去一分子鼠李糖（rha）得到碎片离子（m/z653.4），再脱去一分子葡萄糖（glc），得到m/z490.9的碎片离子，裂解途径见图3。

图3 拟人参皂苷F11质谱裂解途径Fig 3 Fragmentation pathway of pseudoginsenoside F11

4.3 评价石斛夜光丸中人参掺伪投料情况

本研究结果显示，35批石斛夜光丸检出含有西洋参，不合格率为38.5%，18家生产企业中8家企业样品检出拟人参皂苷F11超出限度，可见人参掺伪问题严重。中成药中人参多以粉末入药，西洋参与人参以粉末入药时极为相似难以通过外观进行有效区分，多数中成药现行标准以人参皂苷Rb1、Re和Rg1作为检验指标，西洋参各部位（茎叶、主根、须根、芦头、根皮、根心等）均含人参皂苷Rb1、Re和Rg1，仅含量存在差异，以总量计含量大于人参[15-18]。调研发现，西洋参价格与人参相当甚至更高，而西洋参须和西洋参边角料价格仅为西洋参价格的20%左右。因此，不法商家以西洋参须或西洋参边角料代替人参投料。

4.4 总结

近年来发现的中成药人参中西洋参掺伪问题较为严重，亟需得到重视。本研究首次建立了HPLCELSD法测定石斛夜光丸中拟人参皂苷F11的含量，同时建立了UPLC-MS/MS法，两种方法都能够准确有效地判断石斛夜光丸中是否有西洋参掺伪投料，为评价石斛夜光丸等含人参中成药中人参投料情况提供了技术支持。