基于网络药理学和分子对接探讨保和丸“异病同治”非酒精性脂肪肝和功能性消化不良的分子机制❋

王海坤,吴毓婷,吴 娜,苏 丹△

(1.安徽医科大学附属亳州医院,安徽亳州 236800;2.中国科学技术大学附属第一医院,合肥 230001)

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是以脂肪在肝脏细胞内堆积为主要临床表现的病理疾病,脂肪堆积超过5%即可明确诊断。其发病机制较为复杂,除酒精、肝病、药物等因素导致的脂肪肝外,其他均可归为NAFLD。近年来,NAFLD的发病率不断攀升[1],已成为我国严重的公共卫生问题,但却无良好的治疗手段。功能性消化不良(functional dyspepsia,FD)是以持续性或反复性上腹痛、恶心嗳气、早饱等为主要临床表现的功能性胃肠病[2],主要累及胃和十二指肠,无器质性病变。FD是临床较为常见的一种疾病,但治疗效果却不尽如人意,主要存在反复发作、缓解期短等问题。有研究表明,相较于无肝病的患者,NAFLD患者的FD发病率更高[3]。随着NAFLD合并FD的患者数量越来越多[4],如何有效治疗NAFLD和FD两种疾病是目前临床研究的重要目标。

NAFLD和FD虽为两种不同的疾病,但病机均属肝郁脾虚型,NAFLD以肝体用失调,脾虚不分清浊为主要特征[5],若肝失疏泄、克脾犯胃,脾胃功能失常,可能导致FD[6]。中医认为,肝主疏泄,脾胃主升降运化,二者相互协调促进,同时也存在相互克制的关系,因此肝胃同病应肝胃同治[4]。保和丸出自《丹溪心法》,常用于治疗食积。现代研究表明:保和丸具有一定的调血脂作用,对高脂血症、NAFLD的治疗效果良好,且对功能性消化不良治疗作用明显[7]。由于中药成分的复杂性,保和丸治疗NAFLD和FD的分子机制仍未得到阐明。本研究拟从中药组分、靶点、作用途径的系统性角度出发,基于网络药理学,探讨保和丸对NAFLD和FD “异病同治”的分子机制,并利用分子对接手段,对核心成分和靶点的亲和性进行初步验证,为该药的下一步研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 保和丸化学成分及对应靶点的提取

保和丸的组方包括山楂、神曲、半夏、茯苓、陈皮、连翘、莱菔子、麦芽八味中药[8]。基于TCMSP平台(www.old.tcmsp-e.com)获取组方中半夏、茯苓、陈皮、连翘、莱菔子、麦芽的化学成分;中药山楂、神曲TCMSP平台未收录,基于化学专业数据库(www.organchem.csdb.cn)获取其相应化学成分,并基于相关文献对两味中药的成分进行补充[9-12]。将获取的所有化学成分返回TCMSP平台,以类药性(DL)≥0.18和口服生物利用度(OB)≥30%为标准[13],筛选符合标准的化学成分并提取对应靶点。由于不同平台的算法不同,成分靶点提取时TCMSP平台与其他平台混用有失严谨,因此,本研究对从其他平台或文献检索得到而TCMSP平台未包含的成分予以剔除处理。运用UniProtKB数据库(www.uniprot.org)将提取的靶点名称统一为人类官方基因简称,并删除重复项。

1.2 保和丸治疗NAFLD和FD的交集靶点的获取

采用“non-alcoholic fatty liver disease”“functional dyspepsia”作为关键词,分别检索GeneCards(www.genecards.org)、DrugBank(go.drugbank.ca)、NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)、PharmGKB(www.pharmgkb.org)、OMIM(omim.org)、TTD(db.idrblab.net/ttd)数据库,搜集NAFLD和FD疾病靶点基因,并去重。采用R语言(v3.6.0)的VennDiagram包将保和丸化学成分对应靶点、NAFLD疾病靶点、FD疾病靶点取交集,获得保和丸“异病同治”NAFLD和FD的交集靶点。

1.3 “药物-成分-靶点”网络的建立

将保和丸化学成分及交集靶点信息导入Cytoscape 3.8.0软件中,建立“药物-成分-靶点”网络。使用Network Analyer插件分析上述网络节点的特性,筛选Closeness centrality (CC)、Degree centrality (DC)、Betweenness centrality (BC)三个参数均大于各自均值的节点[14],进行2次后,获得保和丸治疗NAFLD和FD的核心成分。

1.4 蛋白互作(PPI)网络的建立

将1.2项保和丸治疗NAFLD和FD的交集靶点导入String平台(www.string-db.org),模式选择“Multiple proteins”,种属选择“Homo sapiens”,置信度设为“≥0.90”,并点选“hide disconnected nodes”,建立PPI网络并导出tsv文件。将该文件导入Cytoscape 3.8.0软件,使用CytoNCA插件分析网络节点的特性,筛选CC、DC、BC、Network centrality (NC)、Eigenvector centrality (EC)、Local average connectivity (LAC)六个参数均大于各自均值的节点,进行2次后,获得核心靶点。

1.5 GO功能及KEGG通路富集分析

使用R语言(v3.6.0)的org.Hs.eg.db包,将1.2项交集靶点的名称替换为entrez ID。使用R语言的clusterProfiler、enrichplot等包,对替换后的交集靶点ID进行GO功能及KEGG通路富集分析,阈值设定:P值及校正后的P值(q值)均<0.05。按富集数量由大到小排列,使用R语言的ggplot2包对GO功能富集分析结果前10位、KEGG通路富集分析结果前20位进行可视化,使用pathview包对KEGG关键信号通路进行可视化。

1.6 分子对接验证

将1.3项的核心成分和1.4项的核心靶点进行分子对接验证。采用PubChem数据库(pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)逐一下载核心成分对应化合物的2D结构,使用Chem3D软件将结构转换为3D,计算最小自由能,对结构进行优化,获得相应的小分子配体(“Mol2”格式)。采用PDB数据库(www.rcsb.org)逐一下载核心靶点对应蛋白的3D结构,使用PyMol软件去除结构中的异质分子和水分子,获得相应的蛋白受体(“pdb”格式)。采用AutoDock Tools软件确定小分子配体的可扭转键,并对蛋白受体进行加氢等操作,二者均转存为“pdbqt”格式;采用Gird模块设置对接盒子参数:Spacing (angstrom)设定为1.000,盒子大小设置为可覆盖受体的所有活性位点。运用AutoDock vina软件进行分子对接并统计结合能。结合能的大小与对接活性成反比(<0 kcal/mol:小分子配体与蛋白受体具有自发结合的活性;<-5 kcal/mol:二者具有良好的对接活性;<-7 kcal/mol:二者具有强烈的对接活性)[15]。运用PyMol软件对部分结合能较小的对接结果进行可视化。

2 结果

2.1 保和丸化学成分的筛选结果

基于TCMSP平台及1.1项筛选标准,获得半夏、茯苓、陈皮、连翘、莱菔子、麦芽的化学成分共77种。基于化学专业数据库获得山楂、神曲的原始化学成分20种,并基于相关文献补充获得原始成分185种,将以上205种成分返回TCMSP平台,按1.1项标准进行筛选。由于不同平台的算法不同,混用有失严谨,对以上205种成分中TCMSP平台未包含的成分予以剔除处理。合并以上成分后,去重得75种,部分化学成分信息见表1。

表1 保和丸部分化学成分

2.2 “药物-成分-靶点”网络分析结果

共获取保和丸化学成分对应靶点1 362个,去重后得263个;获得NAFLD疾病靶点1 749个,FD疾病靶点4 128个。将三者取交集,筛选出保和丸“异病同治”NAFLD和FD的交集靶点基因112个,见图1。

图1 保和丸治疗非酒精性脂肪肝和功能性消化不良交集靶点的Venn图

“药物-成分-靶点”网络构建结果见图2(该图分左右两个矩阵,左边矩阵上的节点代表保和丸化学成分,节点上的编号为成分的TCMSP ID。饼图颜色表示该成分的来源中药,例:红色表示该成分的来源中药为半夏,各颜色对应中药如下:红:半夏,蓝:陈皮,灰:茯苓,白:连翘,黄:麦芽,青:山楂,绿:神曲。多种颜色表示该成分为几种中药共有。由于莱菔子的化学成分没有靶点与之产生直接或间接联系,因此矩阵中未出现该药。右边矩阵代表保和丸“异病同治”NAFLD和FD的交集靶点,节点的大小与成分-靶点相关度成正比,包含150个节点和355条边,即38种化学成分与112个靶点之间产生了355种直接或间接联系。利用Network Analyer插件筛选后,获得参数(CC、DC、BC)均大于各自均值(0.380 1、11.00、0.020 0)的核心成分共6种,分别为:luteolin(木犀草素)、quercetin(槲皮素)、wogonin(汉黄芩素)、kaempferol(山柰酚)、naringenin(柚皮素)、nobiletin(川陈皮素)。

图2 保和丸治疗非酒精性脂肪肝和功能性消化不良的“药物-成分-靶点”网络图

2.3 PPI网络分析结果

PPI网络由104个节点和382条边组成,采用CyoNCA插件共筛选出参数(DC、NC、BC、EC、CC、LAC)均大于各自均值(15.00、5.806 9、335.24、0.142 5、0.230 4、4.40)的核心靶点共8个,包括肿瘤蛋白p53(tumor protein p53,TP53)、细胞核因子kp65蛋白(nuclear factor KP65 protein,RELA)、雌激素受体1(estrogen receptor 1,ESR1)、人源重组蛋白(recombinant human protein,HSP90AA1)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase,AKT1)、丝裂原激活蛋白激酶14(mitogen-activated protein kinase 14,MAPK14)、JUN原癌基因(Jun proto-oncogene,JUN)、MYC原癌基因(Myc proto-oncogene,MYC),流程见图3。

图3 保和丸治疗非酒精性脂肪肝和功能性消化不良交集靶点的PPI网络中核心靶点的筛选流程图

2.4 GO功能及KEGG通路富集分析结果

保和丸治疗NAFLD和FD交集靶点的GO功能共富集到2 217个生物学过程(biological process,BP)条目,77个细胞组分(cell components,CC)条目,162个分子功能(molecular function,MF)条目。其中,BP主要涉及营养水平反应(response to nutrient levels)、营养反应(response to nutrient)、甾体激素反应(response to steroid hormone)等;CC主要涉及膜筏(membrane raft)、膜微区(membrane microdomain)、膜区域(membrane region)等;MF主要涉及DNA结合转录激活因子活性及RNA聚合酶Ⅱ特异性(DNA-binding transcription activator activity, RNA polymerase Ⅱ-specific)、蛋白酶绑定(protease binding)、甾体激素受体活性(steroid hormone receptor activity)等,见图4。

图4 保和丸治疗非酒精性脂肪肝和功能性消化不良交集靶点的GO功能富集分析气泡图

KEGG共富集到162条通路,见图5。富集数量排名靠前的通路主要包括脂质和动脉粥样硬化(lipid and atherosclerosis)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)信号通路、白介素(interleukin,IL)-17信号通路、内分泌阻力(endocrine resistance)、缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)-1信号通路等。选择图中与NAFLD及FD相关性较大的HIF-1信号通路进行可视化,见图6。

图5 保和丸治疗非酒精性脂肪肝和功能性消化不良交集靶点的KEGG通路富集分析气泡图

图6 保和丸治疗非酒精性脂肪肝和功能性消化不良的HIF-1信号通路图

2.5 分子对接结果

NAFLD与FD共有的核心靶点蛋白与保和丸核心活性成分的分子对接结合能情况见表2。可见,全部结合能均<-5 kcal/mol,大部分<-7 kcal/mol,表明所有核心成分与靶点结合活性良好,大部分结合活性强烈,核心成分与靶点间的关联性很强。这些成分和靶点可能是保和丸“异病同治”NAFLD与FD的主要成分和靶标。将每个核心靶点蛋白对应的结合能最低的对接组合进行可视化,由于氢键是促使配体与活性点结合的主要驱动力[16],所以同时标出小分子与蛋白之间结合的氢键,见图7。木犀草素可与ATK1蛋白(PDB id:4ekl)的活性点ASP-292、LYS-179、GLU-228、ALA-230形成氢键;木犀草素可与ESR1蛋白(PDB id:1qkt)的活性点LEU-387、HIS-524、GLY-521形成氢键;槲皮素可与HSP90AA1蛋白(PDB id:2ykj)的活性点TRP-162、GLN-23形成氢键;木犀草素可与JUN蛋白(PDB id:5fv8)的活性点LYS-11、ARG-28、ASN-25形成氢键;槲皮素可与MAPK14蛋白(PDB id:1bl6)的活性点LYS-53、ASP-168、PHE-169形成氢键;木犀草素可与MYC蛋白(PDB id:5i4z)的活性点GLN-60形成氢键;山柰酚可与RELA蛋白(PDB id:3qxy)的活性点HIS-252、TYR-285形成氢键;木犀草素可以TP53蛋白(PDB id:2vuk)的活性点LYS-101、GLN-100、ALA-138、SER-166、ARG-196形成氢键。

图7 核心成分与靶点的分子对接模型图

表2 核心成分与靶点的分子对接结合能情况(kcal/mol)

3 讨论

保和丸方剂已被2020版《中华人民共和国药典》收录,主治消食、和胃、导滞[17]。现代临床研究表明:该方可用于胃肠、肝脏、心血管、呼吸系统等疾病,应用广泛,可化裁用于各种肝郁脾虚型疾病[7],具有鲜明的“一方多用、异病同治”的中医特色。

本研究通过“药物-成分-靶点”网络,筛选出木犀草素、槲皮素、汉黄芩素、山柰酚等6种保和丸核心成分。木犀草素具有较强的抗氧自由基作用,可降低氧化应激,增强脂联素受体(adiponectin receptor,adipoR)2的表达,减少肝细胞内脂质的堆积,减轻NAFLD的肝损伤[18],同时也有较好的胃肠损伤保护作用[19]。槲皮素抗氧化应激作用较强,可抑制NAFLD疾病相关因子,减少活性氧的生成、减轻肝细胞炎症等[20],同时可通过干预B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma,Bcl-2)、p38蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)和Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)等因子水平,减轻幽门螺杆菌相关胃炎所致损伤、减少细胞凋亡[21]。汉黄芩素可通过上调肝细胞内过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptor,PPAR)-α和AdipoR2的水平减轻NAFLD的肝损伤[22],同时具有神经稳定作用[23],对精神心理因素导致的FD有一定的疗效。山柰酚可抑制核因子 (nuclear factor,NF)-κB蛋白的核转录活性,发挥体内抗炎活性,阻断NAFLD的进展[24],同时可减轻血管活性肠肽、组胺等因子介导的胃过敏和运动异常[25]。

本研究通过PPI网络筛选出TP53、RELA、ESR1、AKT1等8个核心靶点。TP53与脂肪铁死亡调控相关[26],且是最常见的肠炎发病的基因形态,可能参与FD肠炎发病[27]。RELA是NF-κB通路的重要转录因子,抑制NF-κB通路可减轻NAFLD肝炎症状,且可减轻十二指肠黏膜损伤,治疗FD[28]。ESR1和ATK1均参与脂质代谢和胰岛素信号转导,从而加重NAFLD;此外,十二指肠及胃窦胃底均可检测出ESR1,提示该因子可能具有调节胃肠功能的作用;ATK1是磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路的重要因子,通过作用于下游NO调节酶使NO增多,从而减弱胃肠蠕动[29]。

GO富集结果表明,保和丸可通过调控BP、CC、MF的多条路径治疗NAFLD和FD,主要涉及营养、甾体激素等因素。FD患者饮食状况一般不佳,常伴有营养不良,且有研究显示,各种营养不良状况(包括恶性营养不良、微量元素缺乏、亚临床营养不良等)均可诱发NAFLD[30]。许多甾体激素可通过微调脂质合成、运输和代谢相关基因的表达,调节脂质稳态,这些通路的失调,是NAFLD发病的重要因素[31];同时,FD患者血浆皮质醇(一种甾体激素)水平的升高,是导致胃肠黏膜损伤的决定性因素之一[32]。因此,保和丸可通过作用于营养、甾体激素等因素产生反应,从而治疗NAFLD和FD。KEGG富集结果表明,交集靶点大多富集于脂质与动脉粥样硬化、TNF、IL-17、HIF-1等信号通路,这些通路均与NAFLD、FD具有较大的相关性。研究表明:食物中脂肪的摄入可能会诱发FD患者消化不良症状[33],且体内脂质代谢异常是NAFLD发病的机制之一。TNF和IL-17均是辅助性T细胞(T helper cell,Th)17分泌的重要炎性因子,Th17通路在NAFLD疾病的发展中起着关键作用。TNF不仅可诱导肝细胞炎症与再生、坏死与凋亡[34],而且其亚型TNF-α是评价FD患者病情严重程度的指标之一[35],IL-17也影响着肠道环境的致病免疫应答和抗菌能力[36]。肝脏细胞缺氧是NAFLD的基本特征之一,HIF-1是缺氧诱导因子,通过下调其亚型HIF-1α的表达可抑制肝脏脂肪变性[37],并可减轻消化道损伤[38-39]。分子对接结果显示,保和丸核心成分与靶点的关联性很强,初步验证了以上网络药理学结果的可靠性。

综上所述,保和丸中的木犀草素、槲皮素、汉黄芩素等药效成分可通过作用于TP53、RELA、ESR1、AKT1等靶点,调控TNF、IL-17、HIF-1等信号通路,发挥治疗NAFLD和FD的药理作用。该机制涉及的药效成分、靶点及信号通路比较复杂,符合中药“多组分、多靶点、多途径”的治疗机理,但仍有待进一步的生物学实验验证。