健脾益心方对心肌梗死大鼠炎症及心室重塑的影响

向密，路迎冬，张洋，辛来运，崔向宁

中国中医科学院广安门医院，北京 100053

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是由冠状动脉缺血缺氧导致的心肌组织损伤或缺血性坏死，其发病率和病死率高，病情进展迅速，预后差[1]。心肌重构由MI后一系列病理改变引起或加重，病理表现为心肌肥厚和纤维化，导致心功能障碍、心力衰竭、恶性心律失常，甚至心源性死亡[2-4]。尽管多种技术广泛应用于临床治疗，但仍缺乏更有效的方法[5]。

研究发现，炎症反应参与心肌损伤的发展变化，炎症细胞可通过细胞表型转化、分泌细胞因子和生长因子等影响心脏炎症、梗死面积和心肌纤维化，加重心肌损伤，导致心室重塑，损害心功能[6]。中药可通过多成分、多靶点、多途径综合干预，一定程度上控制炎症反应和心室肥大，抑制急性MI后心室重塑[7]。心脾失调是病理产物“痰”“瘀”产生的直接病因，作为后天之本的脾是MI及MI后心力衰竭发病的重要脏腑。故推测可用祛湿化饮法治疗MI，拟健脾益心方。该方由益气补虚之保元汤[8]与健脾利湿之苓桂术甘汤[9]化裁，有益气健脾、利水行瘀功效，可显著改善心力衰竭患者临床症状、活动耐量及生活质量，改善心功能，减轻炎症[10]。本研究通过左冠状动脉前降支结扎法建立MI大鼠模型，并予健脾益心方干预，观察其对大鼠炎症及心室重塑的影响，明确该方治疗MI 的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级雄性SD大鼠27只，体质量200～220 g，北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物生产许可证号SCXK（京）2020-0004。饲养于中国中医科学院广安门医院实验动物中心SPF级实验环境，温度20～25 ℃，湿度40%～60%，自然光照循环，自由摄食饮水。实验过程按照《实验动物管理和使用规定》进行，并经中国中医科学院广安门医院动物伦理委员会审批（IACUC-GAMH-2022-041）。

1.2 药物

健脾益心方（黄芪30 g，人参10 g，桂枝10 g，茯苓30 g，麸炒白术15 g，泽泻30 g，丹参20 g，大腹皮15 g，葶苈子15 g，当归15 g），饮片由中国中医科学院广安门医院中药房提供，均符合《中华人民共和国药典》规定。按用量取上述中药饮片，加入蒸馏水浸泡30 min，煎煮30 min，过滤，残渣加蒸馏水，继续煎煮30 min，过滤，合并2次滤液，浓缩成含原药材1.9 g/mL药液，分装后置于4 ℃冰箱保存备用。

1.3 主要试剂与仪器

HE 染色试剂盒，货号G1120，北京索莱宝；Masson染色试剂盒，货号BA4079B，珠海贝索生物；4%多聚甲醛，货号P1110，北京索莱宝；TUNEL染色试剂盒，货号11684795910，瑞士Roche；RIPA 裂解液，货号R0010，北京索莱宝；BCA蛋白定量试剂盒，货号PC0020，北京索莱宝；ECL 发光液，货号1705062，美国Bio-Rad；凝胶制备试剂盒，货号161-0183，美国Bio-Rad；10×TBST缓冲液，货号T1081，北京索莱宝；5×蛋白上样缓冲液，货号P1040，北京索莱宝；5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，货号T1070，北京索莱 宝； Bcl-2 抗 体， 货 号26593-1-AP， 美 国Proteintech；Bax 抗体，货号WL01637，沈阳万类生物；细胞色素c（Cytc）抗体，货号11940S，美国CST；Cleaved Caspase-3 抗体，货号9664S，美国CST；NOD 样受体蛋白3（NLRP3）抗体，货号R30750，美国NSJBIO；凋亡相关斑点样蛋白（ASC）抗体，货号DF6304，美国Affinity Biosciences；Caspase-1抗体，货号sc-392736，美国Santa Cruz；核因子（NF）-κB p50抗体，货号ab32360，英国Abcam；白细胞介素（IL）-6抗体，货号ab9324，英国Abcam；IL-1β抗体，货号AF5103，美国Affinity Biosciences；辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，货号bs-40295GHRP，北京博奥森；辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG，货号A0216，上海碧云天。

ALC-V8S 小动物呼吸机，上海奥尔科特；Vevo2100超高分辨率动物专用超声成像系统，加拿大Visual Sonics；CKX53 荧光显微镜，日本Olympus；Mini-PROTEAN 凝胶电泳系统，美国Bio-Rad；DocTMXR+凝胶成像系统，美国Bio-Rad；BY-R20高速离心机，北京白洋医疗器械有限公司；Milli-Q Advantage A10超纯水系统，美国Millipore；Spark®多功能酶标仪，上海Tecan；EG1150 包埋机，德国Leica；SM2010R病理切片机，德国Leica。

2 实验方法

2.1 造模、分组及给药

随机选取18只大鼠，采用左冠状动脉前降支结扎法制备MI模型[11-13]。大鼠腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉，气管插管，侧开胸暴露心脏，用5-0手术缝合线在左冠状动脉前降支距左心耳边缘下2～3 mm处结扎，稳定后可见心脏表面变白。关胸，缝合皮肤。次日检测大鼠术后24 h心电图，根据病理性Q波判断造模是否成功。另取9只作为假手术组，操作相同，但缝合线仅穿过左冠状动脉，不结扎。术后将存活且造模成功的大鼠随机分为模型组和健脾益心方组，每组9只。

造模成功后开始给药，按人与大鼠换算系数计算给药剂量，健脾益心方组予健脾益心方药液19.95 g/kg灌胃，灌胃体积10.5 mL/kg，每日1次，连续4周。假手术组和模型组予等体积生理盐水灌胃。

2.2 超声心动图检测

给药结束后，通过无创超声心动图评估大鼠心脏结构和功能。称量大鼠体质量，腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后，于乳头肌水平记录左室长轴二维超声心动图，测量左室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS）、左室舒张末期前壁厚度（LVAWd）、左室收缩末期前壁厚度（LVAWs）、左室舒张末期内径（LVIDd）、左室收缩末期内径（LVIDs）、左室舒张末期容积（LVEDV）和左室收缩末期容积（LVESV）。以上参数均测量3 个心动周期，取平均值作为最终结果。

2.3 标本采集

超声心动图检测后，于大鼠腹部纵向切口，逐层打开腹腔，轻轻拨开腹腔脏器后进行腹主动脉取血。采血后迅速打开大鼠胸腔，取出心脏，去除其他附着物，用冷生理盐水冲洗干净，称量心脏质量，计算心脏质量比（心脏质量/体质量），评估心脏肥大情况。在最大横径处横切成2部分，心底部分用4%多聚甲醛固定，用于组织病理形态观察和免疫组化检测，心尖部分置于-80 ℃保存，用于Western blot检测。

2.4 心肌组织病理观察

心肌组织经4%多聚甲醛固定过夜后，脱水透明，石蜡包埋，切成4 μm切片，分别行HE 和Masson 染色，光学显微镜下观察心肌组织病理变化，用Image J软件计算心肌纤维化面积比（阳性染色面积÷总面积×100%），评估心肌纤维化严重程度。

2.5 TUNEL染色

心肌组织石蜡切片先用二甲苯浸洗5 min×2次，梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）分别浸泡3 min，PBS漂洗3次，加Proteinase K工作液处理，待玻片干后，加TUNEL 反应液50 μL，PBS 漂洗3 次，荧光显微镜下观察，采用Image J软件分析心肌细胞凋亡率（凋亡细胞数÷总细胞数×100%）。

2.6 Western blot检测

取心肌组织，加入RIPA裂解液提取蛋白，BCA法进行定量分析。以20 μg蛋白上样，经10%凝胶电泳分离，将蛋白转移至PVDF膜，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加Cytc一抗（1∶1 000）、Cleaved Caspase-3一抗（1∶1 000）、Bax 一抗（1∶700）、Bcl-2 一抗（1∶500）、NLRP3一抗（1∶500）、ASC一抗（1∶1 000）、Caspase-1一抗（1∶500）、IL-1β一抗（1∶1 000）、IL-6一抗（1∶1 000）和NF-κB p50一抗（1∶5 000），4 ℃孵育过夜。次日将膜与二抗（1∶10 000）在室温孵育1 h。ECL法曝光，凝胶成像系统成像，使用Image J软件进行分析，以GAPDH或β-tubulin为内参，计算目的蛋白相对灰度值。

2.7 免疫组化染色

石蜡切片加热煮沸3 min热修复抗原，置于60 ℃烤片2 h，脱蜡后，二甲苯和乙醇水合，PBS和双蒸馏水冲洗，滴加Bax 一抗（1∶60）和Bcl-2 一抗（1∶500），4 ℃孵育过夜，加二抗37 ℃孵育30 min，DAB显色，中性树胶封片，镜下观察并拍照。每张切片随机取3个视野，采用Image J软件分析阳性染色面积，计算阳性面积比。

3 统计学方法

采用GraphPad Prism 8.0统计软件进行分析。计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 健脾益心方对模型大鼠心脏结构和功能的影响

与假手术组比较，模型组大鼠LVEF、LVFS、LVAWd、 LVAWs 显 著 减 少（P＜0.01）， LVIDd、LVIDs、LVEDV、LVESV 显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，健脾益心方组大鼠LVEF、LVFS、LVAWd、LVAWs 显著增加，LVIDs、LVESV 显著减少（P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠心脏结构和功能指标比较（±s）

表1 各组大鼠心脏结构和功能指标比较（±s）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

LVESV/μL 41.4± 23.8 266.2±115.1**107.9± 70.8##组别假手术组模型组健脾益心方组只数9 9 9 LVEF/%75.8±12.0 29.3± 5.6**61.1±15.5##LVFS/%46.7±11.8 14.4± 2.9**35.0±12.5##LVAWd/mm 2.3±1.1 1.2±0.3**2.2±0.4##LVAWs/mm 3.4±0.5 1.2±0.3**2.9±0.7##LVIDd/mm 5.8±0.6 8.1±1.6**6.9±1.1 LVIDs/mm 3.1±0.8 7.0±1.5**4.6±1.4##LVEDV/μL 170.5± 38.8 371.7±143.0**256.1± 97.0

4.2 健脾益心方对模型大鼠心脏肥大的影响

与假手术组比较，模型组心脏外观及心脏质量比均表明心脏肥大（P＜0.01）；与模型组比较，健脾益心方组大鼠心脏肥大明显减轻（P＜0.05）。见图1、表2。

图1 各组大鼠心脏形态

表2 各组大鼠心脏质量比比较（±s，mg/g）

表2 各组大鼠心脏质量比比较（±s，mg/g）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05

心脏质量比3.58±0.14 4.36±0.55**3.85±0.44#组别假手术组模型组健脾益心方组只数9 9 9

4.3 健脾益心方对模型大鼠心肌组织病理形态的影响

假手术组大鼠心肌细胞形态正常，心肌纤维排列整齐、结构完整；与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织梗死边缘区细胞排列不规则甚至坏死，有明显炎性细胞浸润，心肌纤维化面积显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，健脾益心方组大鼠心肌组织病理损伤明显减轻，心肌纤维化面积显著减少（P＜0.05）。见图2、表3。

图2 各组大鼠心肌组织形态（×200）

表3 各组大鼠心肌组织纤维化面积比比较（±s，%）

表3 各组大鼠心肌组织纤维化面积比比较（±s，%）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05

纤维化面积比0.83±0.20 8.65±1.16**6.03±1.09#组别假手术组模型组健脾益心方组只数3 3 3

4.4 健脾益心方对模型大鼠心肌细胞凋亡的影响

TUNEL染色蓝色为细胞核，绿色为凋亡细胞。与假手术组比较，模型组大鼠心肌细胞凋亡率显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，健脾益心方组大鼠心肌细胞凋亡率显著降低（P＜0.01）。见图3、表4。

图3 各组大鼠心肌细胞凋亡阳性表达（TUNEL染色，×200）

表4 各组大鼠心肌细胞凋亡率比较（±s，%）

表4 各组大鼠心肌细胞凋亡率比较（±s，%）

注：与假手术组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

凋亡率11.01± 8.63 54.61±22.61**22.45± 7.97##组别假手术组模型组健脾益心方组只数3 3 3

4.5 健脾益心方对模型大鼠心肌组织凋亡相关蛋白表达的影响

Western blot结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织Bax、Cytc、Cleaved Caspase-3蛋白表达显著升高，Bcl-2 蛋白表达显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，健脾益心方组大鼠心肌组织Bax、Cytc、Cleaved Caspase-3 蛋白显著降低，Bcl-2蛋白表达显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。见图4、表5。

图4 各组大鼠心肌组织Bax、Bcl-2、Cytc、Cleaved Caspase-3蛋白免疫印迹

表5 各组大鼠心肌组织Bax、Bcl-2、Cytc、Cleaved Caspase-3蛋白表达比较（±s，相对灰度值）

表5 各组大鼠心肌组织Bax、Bcl-2、Cytc、Cleaved Caspase-3蛋白表达比较（±s，相对灰度值）

注：与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别假手术组模型组健脾益心方组Cleaved Caspase-3 0.29±0.04 0.76±0.04**0.28±0.05##只数5 5 5 Bax 1.92±0.29 2.78±0.38**1.85±0.25##Bcl-2 0.14±0.02 0.08±0.02*0.19±0.04##Cytc 0.02±0.01 0.04±0.01*0.02±0.01#

免疫组化结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织Bax 表达显著升高，Bcl-2 表达显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，健脾益心方组大鼠心肌组织Bax 表达显著降低，Bcl-2 表达显著升高（P＜0.05）。见图5、表6。

图5 各组大鼠心肌组织Bax、Bcl-2阳性表达（免疫组化染色，×200）

表6 各组大鼠心肌组织Bax、Bcl-2表达比较（±s，%）

表6 各组大鼠心肌组织Bax、Bcl-2表达比较（±s，%）

注：与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05

Bcl-2 1.03±0.18 0.67±0.07*1.03±0.12#组别假手术组模型组健脾益心方组只数3 3 3 Bax 0.94±0.23 3.95±0.39**2.54±0.64#

4.6 健脾益心方对模型大鼠心肌组织炎症相关蛋白表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠心肌组织NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-6、NF-κB p50 蛋白表达显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，健脾益心方组大鼠上述蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。见图6、表7。

图6 各组大鼠心肌组织NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-6、NF-κB p50蛋白免疫印迹

表7 各组大鼠心肌组织NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-6、NF-κB p50蛋白表达比较（±s，相对灰度值）

表7 各组大鼠心肌组织NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-6、NF-κB p50蛋白表达比较（±s，相对灰度值）

注：与假手术组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

NF-κB p50 0.42±0.06 1.15±0.20**0.65±0.21#组别假手术组模型组健脾益心方组只数4 4 4 NLRP3 0.06±0.02 0.34±0.09**0.11±0.03##Caspase-1 0.07±0.01 0.11±0.02*0.05±0.01##ASC 0.28±0.10 0.70±0.17**0.23±0.06##IL-1β 0.03±0.02 0.13±0.03**0.04±0.02##IL-6 0.15±0.03 0.25±0.04*0.08±0.03##

5 讨论

根据临床症状，MI可归属中医学“胸痹”“真心痛”等范畴，为本虚标实之证，心之气血阴阳亏虚，致血瘀、气滞、寒凝、痰浊等痹阻心脉，其中气虚痰瘀为主要病机。“心脾相关”理论为从脾治疗心系疾病奠定理论基础[14-16]，脾胃调节免疫炎症的功能被越来越多学者接受。“四季脾旺不受邪”“脾为之卫”强调脾气可抵抗外邪入侵[17]。因此，脾可能通过调节炎症反应实现对MI后心室重塑的保护作用。健脾益心方中黄芪、人参、麸炒白术、茯苓益气健脾，白术、茯苓兼以运化水湿，丹参、当归活血通脉，桂枝温心阳、扶脾阳以助运化，泽泻、大腹皮、葶苈子祛湿利水。诸药合用，调理中焦以助上焦，使脾气得运，痰饮得化，心脉气血调和。

MI后出现心脏结构异常，心功能下降，在超声心动图上主要表现为心脏舒缩功能（LVEF、LVFS）和心室壁厚度（LVAWd、LVAWs）下降，以及心室内径（LVIDd、LVIDs）和容积（LVEDV、LVESV）增加。本实验通过超声心动图评价大鼠心脏功能及形态变化，结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠LVEF、LVFS、 LVAWd、 LVAWs 均 显 著 减 少， LVIDd、LVIDs、LVEDV、LVESV显著增加，提示冠状动脉结扎导致左心室收缩及舒张功能障碍，左室壁变薄，左心室扩张；与模型组比较，健脾益心方组大鼠LVEF、LVFS、LVAWd、LVAWs 明显增加，LVIDs、LVESV明显减少，提示健脾益心方能有效改善大鼠心脏结构及功能障碍。

课题组前期采用液相色谱-质谱法鉴定出健脾益心方中7个化合物，包括2-异丙基-8-甲基菲-3,4-二酮、丹参新醌d、富马碱、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、丹参酮ⅡA。研究表明，山柰酚通过抑制STING/NF-κB通路[18]、调节miR-15b/Bcl-2/TLR4[19]等介导炎症，对心脏/心肌细胞损伤发挥保护作用。木犀草素是一种黄酮类化合物，可通过减少心肌缺血面积、抑制心肌细胞凋亡和减轻炎症改善心肌缺血[20]，还可减轻阿霉素诱导的心脏毒性[21]。β-谷甾醇可能通过抑制炎症反应和氧化应激减轻心脏坏死和细胞凋亡[22]。

细胞凋亡是一种基因调控的细胞死亡形式，参与心肌损伤病理演变过程，导致梗死灶扩张[23]、心室重塑[24]、心功能障碍，甚至心力衰竭[25-26]。抑制心肌细胞凋亡可缓解缺血缺氧引起的心肌损伤[27]。Bcl-2、Bax、Cytc及Cleaved Caspase-3在细胞凋亡中发挥重要作用：线粒体外膜破裂导致Cytc从膜间隙释放到细胞质[28]，与凋亡蛋白酶激活因子和Caspase-9形成凋亡小体，触发Caspase-3 激活，最终导致细胞凋亡[29-30]。Bcl-2可阻断Cytc和凋亡诱导因子释放[31]。Bax能增加线粒体外膜通透性，促进凋亡因子释放[32]。本研究TUNEL染色与蛋白检测结果显示，模型大鼠心肌组织损伤明显，心肌细胞凋亡率显著升高，健脾益心方可抑制心肌细胞凋亡，调控凋亡相关蛋白表达至接近正常水平。NLRP3炎症小体由ASC、NLRP3和Caspase-1蛋白组成，在应激状态下可被激活[27，33]。NLRP3炎症小体通过调节IL-1β、IL-6、IL-18等促炎因子释放发挥炎症作用，不仅促进细胞凋亡的发生，而且加重心肌细胞功能障碍，引发心室重塑和心力衰竭[34-35]。NF-κB是炎症因子表达的主要转录因子，在充血性心力衰竭和心肌肥厚等多种心脏疾病中被激活[36]。NF-κB p50为NF-κB成员之一，具有DNA结合、二聚化及核转位等功能，生理条件下，NF-κB多以p50-p65异源二聚体形式与其抑制因子IκB结合并保持静息状态[37]。研究表明，NF-κB通路在NLRP3炎症小体的调控中发挥重要作用[38-39]。IL-1β 作为关键的促炎因子，主要由Caspase-1 激活，活化后的IL-1β 可启动NF-κB 通路，进而促进IL-6、肿瘤坏死因子-α等炎症因子表达[40]。肿瘤坏死因子-α表达增加不仅促进IL-1β分泌，而且可激活细胞内Caspase信号通路，参与不可逆的凋亡途径[40]。本研究中模型组大鼠心肌组织NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-6、NF-κB p50蛋白表达显著升高，经健脾益心方干预后，心肌组织NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-6、NF-κB p50蛋白表达显著降低，表明其可通过抑制炎症相关蛋白表达，改善模型大鼠心肌组织炎症反应，进而改善心肌结构。

综上，健脾益心方可减轻MI大鼠心肌损伤，改善心脏结构与功能，抑制心室重塑。其心肌保护作用可能是通过下调炎症反应，从而抑制心肌细胞凋亡实现。本研究仅对炎症反应及细胞凋亡的部分机制进行探索，今后将进一步优化实验条件，对多种炎症因子在心肌损伤中的协同、拮抗或其他作用机制及健脾益心方的干预靶点进行深入研究。