肉苁蓉治疗肾阳虚有效部位筛选

苏国明 ，张超 ，华悦 ，程世赞 ，廉婧 ，聂紫璇 ，史辑， ，贾天柱，

1.辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600； 2.辽宁省中药炮制技术产业创新中心，辽宁 大连 116600

肉苁蓉为列当科植物肉苁蓉Cistanche deserticolaY.C.Ma的干燥带鳞叶肉质茎，始载于《神农本草经》，被列为上品，其性温，味甘、咸，归肾、大肠经，有补肾阳、益精血、润肠便功效。可用于肾阳不足、精血亏虚所致阳痿、不孕、腰膝酸软、筋骨无力、肠燥便秘等病症[1]。肉苁蓉含多种类型化学物质，已从肉苁蓉属植物中分离鉴定出的成分包括苯乙醇苷类、环烯醚萜类、木脂素类、寡糖、多糖等，具有神经保护、免疫调节、抗衰老等药理作用[2-5]。

肉苁蓉的苯乙醇苷类成分为补肾阳、提高免疫功能、抗老年痴呆症的活性成分[6]。肉苁蓉总苷能显著提高亚急性衰老小鼠超氧化物歧化酶（SOD）活性，并明显降低小鼠脑、肝脏中脂质过氧化物含量，具有抗氧化及延缓肾脏衰老、提高精子质量等作用[7-8]。肉苁蓉总苷可明显降低正常小鼠水迷宫实验到达终点的时间[9]。肉苁蓉总苷对痴呆小鼠也具有明显改善记忆功能的作用[10]。肉苁蓉总苷能提高模型小鼠淋巴细胞转化能力、腹腔巨噬细胞吞噬功能、NK细胞活性、并可明显增强D-半乳糖致衰老小鼠的免疫功能[11]。肉苁蓉多糖具有显著的免疫活性作用，能够促进小鼠胸腺淋巴细胞增殖[12]。

肾阳虚证为中医临床常见证候，是多种病理、生理变化共同导致的功能紊乱状态[13]。现代医学研究认为，肾阳虚证与神经内分泌免疫网络密切相关，由于介导网络平衡功能的相关物质基因表达出现异常，导致神经内分泌免疫网络功能失衡，可用温补、滋补、填补方法改善肾阳，增强患者的免疫力[14]。肾阳虚调控枢纽定位在下丘脑，下丘脑-垂体-肾上腺轴/甲状腺轴/性腺轴功能障碍和功能低下是肾阳虚证的基础。下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）是维持人体基本生命活动的重要内分泌功能轴之一，肾阳虚证常伴随着下丘脑-垂体-靶腺轴的功能低下，体现在相应肾上腺、甲状腺及性腺内分泌的激素类生物学指标仍然是评价肾阳虚证的重要指标[15]。甲状腺是人体内最大的内分泌腺，主要受下丘脑与垂体调节，下丘脑释放促甲状腺素释放激素（TRH），调节腺垂体分泌促甲状腺激素（TSH），TSH进一步引起甲状腺激素释放[16]，血液甲状腺激素浓度变化通过负反馈调节下丘脑TRH和垂体TSH的分泌，构成下丘脑-垂体-甲状腺轴（HPT轴）的自发性控制环路。三碘甲状腺原氨酸（T3）是诊断甲状腺功能亢进症的特异性指标，甲状腺素（T4）是甲状腺分泌最丰富的激素，肾阳虚患者临床通常表现为甲状腺功能降低[17]，因此反映其功能下降的指标是肾阳虚证较为特异的生理指标[18]。本研究通过灌胃给予丙基硫氧嘧啶复制大鼠肾阳虚模型，比较肉苁蓉不同提取部位总多糖、总寡糖、总苷对HPA轴及HPT轴相关指标的调节作用，筛选肉苁蓉补肾壮阳的有效部位，为后续肉苁蓉酒蒸前后化学成分变化规律及药效变化的作用机制研究提供依据。

1 仪器、试药与动物

酶标仪（型号3530911931），赛默飞世尔（上海）仪器有限公司；自动洗板机（型号HBS-4009），南京德铁实验设备有限公司；恒温振荡器（型号SHA-C），浙江明德仪器有限公司；精密电子天平（型号FA1004B），瑞士梅特勒-托利多公司；电子体温计（型号MC-347），欧姆龙健康医疗（中国）有限公司；通用台式高速冷冻离心机（型号Sigma 3k15），湘仪离心机仪器有限公司；医用离心机（型号TDZ5-WS），曦玛离心机（扬州）有限公司；水浴锅（型号HH-S2），郑州长城科工贸有限公司；电热套（型号PTHW），北京亚欧德鹏科技有限公司；自动包埋机（型号BM450A），湖北伯纳医疗科技有限公司；切片机（型号DQ-100），德国Leica；显微镜（型号CX31RTSF），日本Olympus。

肉苁蓉药材于2019年5月采自内蒙古阿拉善，批号20190508-1，经辽宁中医药大学药学院李峰教授鉴定为列当科植物肉苁蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma的干燥带鳞叶肉质茎，标本保存于辽宁省中药炮制技术产业创新中心。丙基硫氧嘧啶（批号1102C021），北京索莱宝科技有限公司；桂附地黄丸（批号202104053），九芝堂股份有限公司；T3（批号211026）、T4（批号211026）、TSH（批号211026）、环磷酸腺苷（cAMP，批号211026）、环磷酸鸟苷（cGMP，批号211026）、皮质醇（Cor，批号211026）、促肾上腺皮质激素（ACTH，批号211026）、睾酮（T，批号211026）、雌二醇（E2，批号211026）ELISA试剂盒，上海科兴生物科技有限公司。

SPF级SD雄性大鼠48只，体质量180～220g，辽宁长生生物技术有限公司提供，许可证号SCXK（辽）2020-0001。饲养环境湿度50%～80%，温度18～22 ℃。动物实验遵循辽宁中医药大学有关实验动物管理和使用规定。

2 方法与结果

2.1 肉苁蓉有效部位制备

取肉苁蓉药材1 kg，分别以10、8、8倍量水回流提取3次，每次1 h，合并滤液，适当浓缩后加乙醇至体积分数为40%，4 ℃静置过夜，3 000 r/min 离心15 min，反复3次，收集沉淀，即为粗多糖，以Sevage法除蛋白，重复3次，冷冻干燥，得总多糖138.1 g。离心所得上清液，减压浓缩至无醇味，上预处理好的D101大孔吸附树脂柱，收集水洗脱部位和40%乙醇洗脱部位，浓缩，减压干燥，得到总寡糖部分106.6 g和总苷部分79.6 g。计算总多糖、总寡糖、总苷得率分别为13.81%、10.46%、7.86%。

2.2 造模、给药及取材

将48只大鼠随机分为6组，分别为空白组、模型组、阳性药组、肉苁蓉总多糖组（多糖组）、肉苁蓉总寡糖组（寡糖组）和肉苁蓉总苷组（总苷组），每组8只。空白组使用纯水灌胃，其余各组大鼠每日灌胃丙基硫氧嘧啶（10 mg/kg）连续15 d，制备肾阳虚模型。各给药组按体表面积和人与动物临床剂量倍数直接换算法及肉苁蓉各部位得率计算，将肉苁蓉总多糖、总寡糖、总苷分别溶于水中，配制成浓度分别为总多糖14.5 mg/mL、总寡糖11 mg/mL、总苷8.2 mg/mL的溶液。从第16日开始，多糖组（145 mg/kg）、寡糖组（110 mg/kg）、总苷组（82 mg/kg）分别予相应药液灌胃，阳性药组予原药材0.936 g/kg桂附地黄丸混悬液（桂附地黄丸于研钵中研碎，溶于纯水中），灌胃体积均为10 mL/kg，空白组和模型组予等量生理盐水灌胃，每日1次，连续15 d。末次给药后禁食不禁水，24 h后各组大鼠用20%乌拉坦溶液0.6 mL/100 g腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，采血管静置30 min后，3 500 r/min离心15 min，分离血清，-20 ℃保存。大鼠断头取脑，冰上分离下丘脑，-80 ℃冰箱保存。

2.3 肉苁蓉不同提取部位对大鼠一般情况的影响

观察各组大鼠造模前后及给药后的一般状态，包括体质量、进食量、活动情况、精神状态、排便及肛温变化。给药第15日各组大鼠均禁食，自由饮水，记录末次给药24 h后大鼠体质量和肛温。

与空白组比较，模型组大鼠表现为反应迟钝、畏冷蜷缩、饮食减少、小便频数、大便稀溏等，各给药组大鼠上述症状均有所改善。模型组大鼠体质量增长速度明显慢于空白组。阳性药组大鼠体质量在21 d后逐渐趋于稳定，其余各给药组大鼠体质量持续增加。与空白组比较，其余各组大鼠肛温在造模期间均明显降低，各给药组给药后大鼠肛温均不同程度升高。与模型组比较，总苷组和寡糖组大鼠肛温有上升趋势，其中总苷组回升较为明显。见图1。

图1 各组大鼠平均体质量、肛温变化趋势（每组8只）

2.4 肉苁蓉不同提取部位对脏器指数的影响

末次给药后，各组大鼠禁食不禁水24 h，腹腔注射20%乌拉坦溶液0.6 mL/100 g麻醉，腹主动脉取血后，摘取大鼠完整的肾脏、脾脏、睾丸、肾上腺，去掉筋膜及脂肪组织，用滤纸吸干脏器表面血污，分别称定质量，计算脾脏、胸腺、睾丸、肾上腺的脏器指数。脏器指数（%）=脏器质量÷体质量×100%。

与空白组比较，模型组大鼠肾脏指数、脾脏指数、肾上腺指数均显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），睾丸指数呈上升趋势；与模型组比较，寡糖组大鼠肾脏指数呈上升趋势，阳性药组、多糖组、总苷组大鼠脾脏指数均呈上升趋势，各给药组大鼠肾上腺指数呈上升趋势，睾丸指数呈下降趋势，阳性药组大鼠睾丸指数显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠肾脏、脾脏、睾丸、肾上腺指数比较（±s，%，每组8只）

表1 各组大鼠肾脏、脾脏、睾丸、肾上腺指数比较（±s，%，每组8只）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05

肾上腺指数0.006 1±0.001 4 0.004 7±0.000 9*0.005 2±0.001 3 0.005 6±0.001 0 0.005 1±0.000 6 0.005 5±0.000 9组别空白组模型组阳性药组多糖组寡糖组总苷组剂量/（g/kg）0.936 0.145 0.110 0.082肾脏指数0.319 3±0.026 7 0.271 3±0.012 4**0.256 7±0.017 3 0.276 8±0.027 4 0.282 6±0.020 4 0.263 7±0.027 9脾脏指数0.177 3±0.020 7 0.140 3±0.018 7**0.155 2±0.020 5 0.158 2±0.017 6 0.135 8±0.012 1 0.143 6±0.010 3睾丸指数0.545 1±0.046 5 0.579 0±0.035 8 0.521 2±0.071 0#0.541 8±0.054 0 0.564 6±0.038 1 0.568 5±0.026 1

2.5 肉苁蓉不同提取部位对甲状腺激素水平的影响

取冻存血清样品放至室温，检测血清T3、T4、TSH含量，严格按试剂盒说明书操作。

与空白组比较，模型组大鼠血清T3、TSH含量显著升高，血清T4含量下降（P＜0.05）。与模型组比较，各给药组血清T3含量显著降低（P＜0.01）；阳性药组、多糖组大鼠血清TSH含量呈下降趋势，寡糖组、总苷组血清TSH含量显著下降（P＜0.01）；阳性药组、寡糖组及总苷组大鼠血清T4含量上升（P＜0.05，P＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠血清T3、T4、TSH含量比较（±s，每组8只）

表2 各组大鼠血清T3、T4、TSH含量比较（±s，每组8只）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别空白组模型组阳性药组多糖组寡糖组总苷组T4/（mU/L）241.75±20.79 239.42±26.42*253.99± 7.46##232.61±16.41 251.28±28.08#256.41± 5.21##剂量/（g/kg）0.936 0.145 0.110 0.082 T3/（ng/mL）6.74±0.67 7.26±0.93*6.44±0.40##6.50±0.28##6.39±0.23##6.51±0.39##TSH/（ng/mL）13.40±0.84 14.18±0.62*13.71±0.32 14.11±1.09 13.10±1.59##13.03±0.63##

2.6 肉苁蓉不同提取部位对下丘脑-垂体-肾上腺轴相关指标的影响

取冻存血清样品放至室温，检测血清T、E2、ACTH、Cor含量，严格按试剂盒说明书操作。

与空白组比较，模型组大鼠血清T含量显著降低（P＜0.05），血清E2含量呈下降趋势，血清Cor含量呈上升趋势。与模型组比较，阳性药组和寡糖组大鼠血清T含量显著升高（P＜0.05，P＜0.01）；各给药组大鼠血清E2含量均呈上升趋势；阳性药组、寡糖组和总苷组大鼠血清ACTH含量显著升高（P＜0.05，P＜0.01）；阳性药组和总苷组大鼠血清Cor含量显著降低（P＜0.01）。见表3。

表3 各组大鼠血清T、E2、ACTH、Cor含量比较（±s，每组8只）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别空白组模型组阳性药组多糖组寡糖组总苷组Cor/（ng/mL）106.73±2.55 108.62±2.34 116.81±2.32##106.81±2.67 108.43±1.63 76.25±2.30##剂量/（g/kg）E2/0.936 0.145 0.110 0.082 T/（ng/mL）120.62±4.24 113.58±5.56*120.70±5.60#116.53±4.31 122.33±3.44##112.67±4.43（pg/mL）50.18±1.49 49.48±2.52 51.89±2.79 50.11±1.56 51.43±2.28 51.64±1.64 ACTH/（pg/mL）91.96±1.61 91.23±1.55 98.78±2.91##90.92±1.86 94.44±1.35#94.88±1.95#

2.7 肉苁蓉不同提取部位对环磷酸腺苷、环磷酸鸟苷含量和cAMP/cGMP比值的影响

检测各组大鼠血清cAMP、cGMP含量，严格按试剂盒说明书操作，并计算cAMP/cGMP比值。

与空白组比较，模型组大鼠cAMP含量无显著变化，cGMP含量显著升高（P＜0.01），cAMP/cGMP比值呈降低趋势；与模型组比较，阳性药组cAMP含量显著升高，寡糖组cAMP含量显著降低，多糖组、寡糖组、总苷组cGMP 含量均显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。与模型组比较，阳性药组和多糖组cAMP/cGMP比值显著升高（P＜0.05，P＜0.01）。见表4。

表4 各组大鼠血清cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值比较（±s，每组8只）

表4 各组大鼠血清cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值比较（±s，每组8只）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别cAMP/cGMP 剂量/（g/kg）cAMP cGMP空白组模型组阳性药组多糖组寡糖组总苷组0.062±0.005 0.057±0.004 0.064±0.002#0.068±0.002##0.057±0.002 0.061±0.003 0.936 0.145 0.110 0.082 0.78±0.03 0.80±0.04 0.88±0.03#0.84±0.03 0.68±0.03##0.79±0.04 12.55±0.54 13.93±0.61**13.68±0.09 12.25±0.15##12.01±0.68##12.89±0.35#

2.8 肉苁蓉不同提取部位对下丘脑激素mRNA表达的影响

采用RT-PCR检测大鼠下丘脑TRH、促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）mRNA表达。每组大鼠取下丘脑组织4～5个，用TRIZOL试剂盒提取总RNA，进行基因组DNA去除反应、反转录反应，合成cDNA。取反转录产物2 μL，加入18 μL扩增反应体系（上下游引物各0.4 μL，反转录试剂10 μL，DEPC水补足），进行PCR。反应条件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 min，40个循环。大鼠基因引物购自艾科瑞生物工程有限公司，引物序列见表5。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量。

表5 各基因PCR引物序列

与空白组比较，模型组大鼠下丘脑TRH、CRH mRNA表达显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，总苷组大鼠下丘脑TRH、CRH mRNA表达显著上调（P＜0.05），总寡糖组与总多糖组CRH mRNA表达呈上调趋势。见表6。

表6 各组大鼠下丘脑TRH、CRH mRNA表达比较（±s）

表6 各组大鼠下丘脑TRH、CRH mRNA表达比较（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05

CRH 1.00±0.31 0.78±0.19*1.06±0.14 0.77±0.07 0.83±0.14 0.89±0.18#组别空白组模型组阳性药组多糖组寡糖组总苷组剂量/（g/kg）只数0.936 0.145 0.110 0.082 8 8 8 8 8 8 TRH 1.00±0.27 0.82±0.17*1.84±0.14 0.95±0.18 0.96±0.12 1.04±0.09#

2.9 肉苁蓉不同提取部位对肾组织形态的影响

取大鼠右肾组织，用10%多聚甲醛固定过夜、脱水、石蜡包埋，切片（厚度4 μm），HE染色后，晾干封片，于光镜下观察肾组织形态，见图2。

图2 各组大鼠肾组织形态（HE染色，×200）

空白组大鼠肾小管结构清晰，细胞排列整齐；模型组肾间质充血，肾小球肿胀，可见炎性细胞浸润，肾小球囊腔内出现红染，肾小管上皮细胞变性、坏死；与模型组比较，各给药组肾小管损伤明显改善，其中总苷组肾小球肿胀不明显，囊腔内界限清晰，且肾小管肿胀减轻，改善水肿能力最为明显。

3 讨论

肉苁蓉为常用补阳药，治疗肾阳不足、精血亏虚、阳痿不孕、腰膝酸软、筋骨无力等症，且补而不峻。肾阳虚可见畏寒肢冷、夜尿频多、舌淡苔白、脉沉迟无力等虚寒征象[19]。下丘脑-垂体-靶腺轴不同环节和不同程度的功能失调是肾阳虚的主要病理基础[20]，关键环节是下丘脑损伤和功能紊乱。内分泌功能紊乱、激素水平异常是引起肾阳虚的重要因素，大脑垂体分泌的TSH和ACTH调节甲状腺和肾上腺功能，促进T3、T4和Cor合成释放[21]。HPA轴下丘脑室旁核分泌CRH，与ACTH细胞膜上的CRH-R1结合，促进腺垂体分泌ACTH及肾上腺合成和分泌Cor。HPT轴下丘脑释放TRH刺激腺垂体细胞分泌TSH，TSH又可促进T3和T4的合成及分泌，参与机体生长发育、基础代谢等多种功能活动。改善肾功能和下丘脑-垂体-靶腺轴相关激素紊乱[22]对肾阳虚大鼠症状体征、相关激素水平的调节、肾功能的改善均有较好效果。

肉苁蓉主要含苯乙醇苷类、环烯醚萜苷类、多糖、寡糖等成分，其中苯乙醇苷类成分，如松果菊苷、毛蕊花糖苷为2020年版《中华人民共和国药典》规定的肉苁蓉指标性成分，此外还有异毛蕊花糖苷、肉苁蓉苷F、2-乙酰毛蕊化糖苷等苯乙醇苷类成分；苯乙醇苷类成分具有抗疲劳、抗衰老[23]、抗老年痴呆、抗神经退行性疾病等，以及改善生殖功能、抗骨质疏松、保护缺血和保护肝脏等药理作用[24]。环烯醚萜苷类主要有梓醇、益母草苷、6-去氧梓醇、8-表脱氧马钱子酸、京尼平苷酸等，具有内分泌调节、免疫调节、抗炎、抗肿瘤、调节性腺轴激素水平[25]、保护肝脏活性等方面的药理作用。

本实验采用灌胃给予丙基硫氧嘧啶致大鼠肾阳虚模型，正常大鼠皮毛柔顺干爽、有光泽且行动较为活泼，造模后大鼠体毛颜色黯淡，且较为稀疏，反应迟钝，畏冷蜷缩，饮食减少，抱团少动。模型组大鼠体质量、肛温明显下降，肾脏、脾脏、肾上腺指数明显下降，睾丸指数上升，出现明显的肾阳虚症状。模型组大鼠血清T4含量下降，T3、TSH含量上升，cAMP含量无明显变化、cGMP 含量显著升高。下丘脑TRH、CRH mRNA表达显著降低。各给药组对TSH有回调作用，总苷组对TSH回调效果显著；寡糖组和总苷组下丘脑CRH mRNA表达水平上升，总苷组上升最为明显；多糖组、寡糖组和总苷组TRH mRNA表达水平均升高，总苷组升高最为明显。表明肉苁蓉对肾阳虚大鼠的HPT轴稳态有很好的调节作用。

HPA 轴相关指标测定显示，模型组大鼠血清ACTH、T、E2含量下降，Cor含量上升。总苷组、多糖组和总寡糖组T、E2含量升高，寡糖组和总苷组ACTH含量上升，多糖组和总苷组Cor含量下降。其中总苷组对T、E2、T4、ACTH和Cor的调节作用最明显，表明肉苁蓉总苷对HPA轴功能稳态有很好的调节作用。

综上，肉苁蓉的总苷类成分、总多糖和总寡糖均可有效改善脾脏、睾丸、肾上腺脏器指数，以及HPA轴和HPT轴相关指标，其中总苷组表现最佳。后续将对总苷成分和总多糖物质在炮制过程中的变化规律进行深入研究。