不同采收时间野生酸枣与野生抚育酸枣各部位化学成分含量变化研究

陈佳昕 ，史鑫波 ，唐志书， ，宋忠兴 ，王磊 ，李国龙 ，李宝剑 ，刘红波

1.陕西中医药大学，陕西中药资源产业化省部共建协同创新中心，秦药特色资源研究开发国家重点实验室（培育），陕西 咸阳 712083；2.中国中医科学院研究生院，北京 100700； 3.长春中医药大学，吉林 长春 130000

酸枣Ziziphus jujubaMill.var.Spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou 为鼠李科枣属野生灌木或小乔木[1]，原产于我国，《神农本草经》称“棘”，俗称野枣、山枣、角针、五眼果等[2]，是国家公布的第一批药食同源品种（卫法监发〔2002〕51号）。酸枣主要分布于河北、陕西、山西、河南等地，多生长于干旱的低山丘陵地区[3-5]，既是干旱山地重要的生态树种，也是绿化荒山的理想树种和枣的优良砧木[6]，其叶、果肉、种仁、根等均有很高的利用价值[7-10]。酸枣仁为临床常用的安神类中药。目前，睡眠障碍已成为严重的社会和民生问题，酸枣仁镇静安神和缓解失眠疗效显著[11]，市场需求逐年增长。但长期以来，酸枣资源主要来源于野生，野生酸枣资源开发利用存在较多问题。野生酸枣种质资源混杂、缺乏优良品种；丰产性差，品质均一性无法保障；生长环境差，导致其挂果率低，产量小。人工采摘难度较大，抢青采摘及毁树式的采收方式使野生酸枣资源储量严重萎缩[12-13]，科学推广酸枣人工种植是行业发展必然趋势。

中药材野生抚育是根据动植物药材生长特性及对生态环境条件的要求，在其原生或相类似的环境中，人为或自然增加居群内个体数量，使其资源量达到能为人们采集利用的生产方式[14]。根据酸枣耐旱、耐寒、耐碱等生长习性[15]，采用野生抚育技术提升酸枣资源品质，是推动酸枣产业高质量发展的有效途径，但野生抚育酸枣与野生酸枣在有效成分含量上是否存在差异尚缺乏研究。本研究比较不同采收时间野生与野生抚育酸枣中各部位有效成分含量，为野生抚育酸枣的有效性及可推广性提供依据，为酸枣资源保护和充分利用奠定基础。

1 仪器与试药

Agilent 1260型高效液相色谱仪，连接紫外检测器（DAD）和蒸发光散射检测器（ELSD），美国安捷伦科技有限公司；RE-2000B型旋转蒸发仪，郑州科泰实验设备有限公司；KQ-300DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；101型电热鼓风干燥箱，北京中兴伟业仪器有限公司；Sartorius CPA225D十万分之一电子分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

斯皮诺素（纯度≥98%，批号111869-201203），中国食品药品检定研究院；6＇＇＇-阿魏酰斯皮诺素（纯度≥98%，批号P04J12S136476）、酸枣仁皂苷A（纯度≥98%，批号P08A8F33617）、酸枣仁皂苷B（纯度≥98%，批号A19GB158349）、酸枣仁皂苷D（纯度≥98%，批号A28HB181012），上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯，Honeywell；超纯水，自制。

酸枣不同部位样品采收时间为2022年5-10月，野生抚育酸枣采自陕西省咸阳市淳化县仲山山区酸枣野生抚育基地，野生酸枣采自陕西咸阳淳化县仲山山区。经陕西中药资源产业化省部共建协同创新中心宋忠兴主任药师鉴定为鼠李科枣属植物酸枣Ziziphus jujubaMill.var.Spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chou的叶、果肉、种仁。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液

取对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成分别含斯皮诺素217.80 μg/mL、6＇＇＇-阿魏酰斯皮诺素208.80 μg/mL、酸枣仁皂苷A 261.40 μg/mL、酸枣仁皂苷B 180.36 μg/mL、酸枣仁皂苷D 154.00 μg/mL的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液

将酸枣叶、酸枣果肉及酸枣仁样品置于烘箱中，60 ℃进行干燥处理，取干燥后的各样品适量，粉碎（过四号筛），称取样品粉末1 g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇20 mL，密塞，称定质量，超声（功率300 W，频率40 kHz）提取1 h，放至室温，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，过0.22 μm有机滤膜，即得。

2.2 色谱条件

采用Agilent 5 TC-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈（B）-水（A），梯度洗脱（0～20 min，10%～32%B；20～40 min，32%～44%B；40～50 min，44%～60%B；50～55 min，60%～10%B；55～65 min，10%～10%B），DAD/ELSD 串联检测，柱温30 °C，检测波长335 nm，流速1.0 mL/min，进样量10 μL。ELSD参数：增益105 ℃，漂移管温度 70 ℃，气压0.7 MPa。按上述色谱条件进行分析，各成分的分离度良好，对照品和供试品HPLC图见图1。

图1 酸枣仁对照品和供试品HPLC-DAD/ELSD图

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察

精密吸取“2.1.1”项下混合对照品溶液，稀释成系列浓度梯度的混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪进行分析，以峰面积为纵坐标、对照品浓度为横坐标进行线性回归，得到各成分的回归方程及线性范围，见表1。

表1 酸枣5种成分线性关系考察结果

2.3.2 精密度试验

取“2.1.1”项下混合对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，结果显示，斯皮诺素、6＇＇＇-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B和酸枣仁皂苷D的RSD分别为0.26%、0.17%、2.49%、2.78%、3.64%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验

取“2.1.2”项下同一批酸枣仁供试品溶液6份，按“2.2”项下色谱条件进行测定，根据色谱峰面积计算各成分RSD，结果表明，斯皮诺素、6＇＇＇-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B和酸枣仁皂苷D的峰面积RSD 分别为4.52%、4.73%、0.99%、4.56%和4.02%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验

取“2.1.2”项下同一批酸枣仁供试品溶液，分别于制备后0、2、4、8、12、24 h，按“2.2”项下色谱条件进样测定，根据各成分色谱峰面积计算RSD，结果表明，斯皮诺素、6＇＇＇-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B 和酸枣仁皂苷D 的RSD 分别为3.61%、2.55%、3.87%、2.39%和2.16%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.5 加样回收率试验

取已知含量的酸枣仁样品6份，每份约0.5 g，精密称定，按“2.1.2”项下方法平行制备供试品溶液，分别精密滴加对照品溶液1 mL，按“2.2”项下色谱条件进样分析，计算各成分回收率。结果斯皮诺素、6＇＇＇-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B及酸枣仁皂苷D的平均回收率分别为99.04%、98.57%、98.13%、98.25%、97.41%，RSD分别为1.93%、1.49%、1.88%、2.52%、3.36%，表明加样回收率良好。

2.4 样品含量测定

取不同采收时间的酸枣叶、酸枣果肉及酸枣仁样品适量，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，计算5种成分的含量，结果见表2～表4。

表2 不同采收时间野生与野生抚育酸枣叶5种成分含量（%，n=3）

表3 不同采收时间野生与野生抚育酸枣果肉5种成分含量（%，n=3）

2.4.1 不同采收时间酸枣叶5种成分含量变化趋势

对不同采收时间野生与野生抚育酸枣叶中斯皮诺素、6＇＇＇-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B及酸枣仁皂苷D的含量进行分析。5月份酸枣叶中皂苷类成分含量较低未检测出，仅检测到少量黄酮类成分，分析其原因可能是，仲山山区海拔较高，4月初至5月初气温较平原地区偏低，枝叶还并不茂盛，新陈代谢较慢，次生代谢产物合成累积量偏少。随生长期延长，野生酸枣叶与野生抚育酸枣叶中斯皮诺素、6＇＇＇-阿魏酰斯皮诺素和酸枣仁皂苷D含量相近，变化趋势基本一致。野生酸枣叶中酸枣仁皂苷A含量较高于野生抚育酸枣叶，两者随生长期的变化趋势一致。野生酸枣叶与野生抚育酸枣叶中酸枣仁皂苷B含量相近，生长前期野生抚育酸枣叶中酸枣仁皂苷B含量高于野生酸枣叶。不同采收时间野生与野生抚育酸枣叶中5种成分含量变化趋势见图2。

图2 不同采收时间野生与野生抚育酸枣叶5种成分含量变化趋势

2.4.2 不同采收时间酸枣果肉5种成分含量变化趋势

野生和野生抚育酸枣果肉中皂苷类成分均含量较低，3种酸枣仁皂苷均未达到检测限，仅检测到斯皮诺素和6＇＇＇-阿魏酰斯皮诺素。野生与野生抚育酸枣果肉中斯皮诺素含量呈先降低后上升趋势，且野生抚育酸枣果肉中斯皮诺素含量较高。6＇＇＇-阿魏酰斯皮诺素含量整体呈降低趋势，野生酸枣果肉的含量略高于野生抚育酸枣果肉。不同采收时间野生与野生抚育酸枣果肉中斯皮诺素、6＇＇＇-阿魏酰斯皮诺素含量变化趋势见图3。

图3 不同采收时间野生与野生抚育酸枣果肉2种成分含量变化趋势

2.4.3 不同采收时间酸枣仁5种成分含量变化趋势

2020年版《中华人民共和国药典》规定酸枣仁皂苷A 的质量分数不少于0.030%，尚未规定酸枣仁皂苷B和酸枣仁皂苷D的质量分数[16]。本研究中，野生和野生抚育酸枣仁中酸枣仁皂苷D含量较低，9月25日及之前采集的样品均未检测到，在10月份完全成熟期检测到少量该成分，其余4种成分均可检测到。随着生长期延长，野生和野生抚育酸枣仁中斯皮诺素含量变化趋势基本一致，在前期生长过程中，酸枣仁成分含量积累差异较大，后期逐渐趋于平稳。野生和野生抚育酸枣仁中6＇＇＇-阿魏酰斯皮诺素含量逐渐上升，两者变化趋势相似。野生和野生抚育酸枣仁中酸枣仁皂苷A含量均呈现上升趋势。野生抚育酸枣仁中酸枣仁皂苷B含量普遍高于野生酸枣仁。在9月9日之后采收的野生和野生抚育酸枣仁斯皮诺素和酸枣仁皂苷A含量均高于药典规定的质量分数，由此可知，以9月下旬至10月上旬采收酸枣仁为宜。不同采收时间野生与野生抚育酸枣仁中斯皮诺素、6＇＇＇-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B含量变化趋势见图4。

图4 不同采收时间野生与野生抚育酸枣仁4种成分含量变化趋势

3 讨论

2020年版《中华人民共和国药典》规定，酸枣仁的指标性成分为酸枣仁皂苷A和斯皮诺素，难以全面评价酸枣仁质量。酸枣仁中发挥镇静安神功效的主要是黄酮类和皂苷类成分[17-20]，本研究选择黄酮类成分斯皮诺素和6＇＇＇-阿魏酰斯皮诺素，以及皂苷类成分酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B及酸枣仁皂苷D作为待测成分，为野生酸枣和野生抚育酸枣的品质评价提供依据。

本研究比较不同采收时间野生与野生抚育酸枣叶、果肉及种仁斯皮诺素、6＇＇＇-阿魏酰斯皮诺素、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B及酸枣仁皂苷D含量，结果表明，野生和野生抚育酸枣不同部位5种化学成分含量变化差异较小。酸枣叶目前主要作茶饮，具有安神功效。有文献报道，酸枣叶作茶饮最佳采收时间为5-6月[21]。本研究中，5月份采收的酸枣叶中3种酸枣仁皂苷均未检测到，可能由于地理环境、气候条件等因素差异导致。6-7月份时各成分含量较其他采收期高，作茶饮可在此时期采摘。6月份后采收的酸枣叶中，5种成分均可检测到，故酸枣叶可作为提取酸枣黄酮类成分和皂苷类成分的新药用部位，以扩大药源，其药效仍需进一步研究。酸枣果肉仅检测到少量黄酮类成分，未检测到皂苷类成分，反映了我国传统中医药理论关于酸枣种仁入药的合理性。本研究结果表明，9月下旬至10月上旬，酸枣仁完全成熟后其黄酮类和皂苷类成分含量相对最高，为保证酸枣仁质量，可将该时段作为最佳采收期。酸枣活性成分的累积趋势可能与不同发育阶段及相应的生理代谢活动等相关，此方面内容有待进一步研究。本研究根据酸枣在不同生长阶段呈现不同的性状特征，参考不同生长发育期成分累积特点划分药材的合理采收期。野生酸枣与野生抚育酸枣中各成分含量随生长期的变化规律基本相似、含量相近，甚至野生抚育酸枣一些成分含量高于野生酸枣，因此酸枣野生抚育技术不仅可以提供丰产性，解决酸枣供需矛盾，而且酸枣仁品质有保障，有利于促进医药健康产业经济高质量发展。