藜霜霉病病原菌的鉴定

2023-11-02高国香

工业微生物 2023年5期

高国香，王艳，2*，张婷

1.甘肃中医药大学药学院，甘肃兰州 730000；2.西北中藏药省部共建协同创新中心，甘肃兰州 730000

藜（Chenopodium album L.）是苋科藜属的一年生草本植物，别名“灰条菜”“灰灰菜”，常生于路旁、荒地及田间，在全国各地都有分布[1]。藜具有较强的抗逆性，常常与作物争夺水分和养料，致使作物减产，是中国北方田间常见的杂草之一[2]。但由于其表面特殊的“盐囊泡”结构，具有耐干旱、抗盐碱等优良特性，有望用于改良盐碱地[3]。其营养价值、适口性与豆科、禾本科的牧草基本相似，因此亦有较高的饲用价值[4]。现代医学研究表明，藜含有挥发油、藜碱、黄酮类化合物、有机酸、多糖、甾醇等多种有效活性成分，具有抑菌、抗氧化、止痒、止泻痢、治痢疾腹泻的功效[5-9]，亦能预防贫血、促进儿童生长发育、为中老年人补充钙质[10]。发生在藜上的病害主要有叶斑病[11-12]、霜霉病[13-14]等。本文拟对甘肃省采集的藜霜霉病病原菌进行鉴定，以期为病害的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 标样采集

本研究于2020 年8 月在甘肃省张掖市民乐县南丰乡秦家庄村（100°92′ E，38°27′ N，海拔2 681 m）进行了对藜霜霉病的病害调查，描述了其症状并拍照记录，采集了标样并压制成了标本。

1.2 病原菌形态鉴定

从干燥标本发病叶片的背面刮取菌样置于载玻片上，滴加一滴乳酸，盖上盖玻片，用酒精灯缓慢加热，在显微镜（BX51-32H01，Olympus，日本）下观察病原菌的形态，测定其大小，并拍照记录。

1.3 DNA 提取、PCR 扩增和系统发育树构建

根据尹玲等[15]的研究，本研究尝试利用一种改良的CTAB 法提取病原菌的DNA。利用引物对ITS300/ITS4[16]、OomCoxI-Levup/OomCoxI-Levlo 和cox2-F/cox2-R 分别扩增病原菌的ITS rDNA、cox1、cox2 mtDNA 片段。PCR 的反应体系为20 μL，其中包括2×Taq PCR Mix 10 μL，模板DNA 2 μL，上下游引物各1 μL（10 μmol/L），ddH2O 6 μL，将其混合均匀并离心，置于PCR 仪（Agilent Sure Cycler 8800，博日科技有限公司）中进行扩增。PCR 反应程序为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 min，循环40 次；72 ℃延伸1 min。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，所得目标产物委托上海生工生物工程有限公司进行纯化和测序。登录GenBank，将所得序列在NCBI 中进行比对，下载相关序列，利用MEGA X 软件中的邻接法（N-J）构建系统发育树[17]。

2 结果与分析

2.1 病原菌形态学特征

藜霜霉病病原菌孢子囊呈褐色或淡褐色，形状为圆形或椭圆形，长23.75～35.36 μm（平均28.70 μm），宽18.74～28.69 μm（平均23.50 μm），分布较多，图1 为藜霜霉病病原菌孢子囊的两种不同形态。

图1 藜霜霉病病原菌孢子囊形态

2.2 系统发育分析

菌株LSM 的cox1、cox2、ITS 基因序列测序得出其长度分别为516 bp、381 bp、478bp，（登录号正在提交），将三个序列利用BLAST 进行比对后下载相关序列，构建cox1-cox2-ITS 基因序列联合的系统发育树，如图2 所示。从构建完成的系统发育树中可以看出，树分为两个大支，一支上的四个菌株分别为寄生在苋科植物菠菜Spinacia oleracea 上的P.effusa、寄生在苋科植物红甜菜B. vulgaris subsp.vulgaris 上的P. schachtii、霜霉属的模式种酸模霜霉、寄生在石竹科植物田野牛漆姑Spergularia rubra上的P. lepigoni；另一支为本菌（菌株“LSM”）与四个藜麦霜霉，分别为寄生在藜上的三个菌株菌株S2019-8、2018-1、10CHE 及寄生在藜麦上的菌株S2019-23。基于寄主植物、病原菌的形态特征见表1，结合形态学鉴定结果，将该菌鉴定为藜麦霜霉菌Peronospora variabilis。