miR-483-5p促进膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭

程 超,汪家伟,王国伟,汪 浩,黄后宝,李亚伟

(1.皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 泌尿外科,安徽 芜湖 241001;2.中山大学附属第五医院 泌尿外科,广东珠海 519000)

膀胱癌是全球最常见的癌症之一。在中国,膀胱癌在泌尿系统肿瘤中的病死率和发病率最高[1-2]。与非肌层浸润性膀胱癌患者(70%)相比,肌层浸润性膀胱癌患者(30%)更易发生转移且预后较差[3-4]。即使肌层浸润性膀胱癌患者经过了最佳治疗,其5年总生存率也会因远处转移的影响而仅有50%[5]。因此,阐明膀胱癌进展的分子机制对于开发更加有效的抗癌疗法具有重要的临床意义。

微RNA(MicroRNA,miRNA)的表达失调与多种癌症的发生有关[6-7]。研究表明,miRNA可以作为潜在的治疗方法,包括使用miRNA模拟物进行miRNA替代疗法或抗miRNA来抑制miRNA功能[8],这些方法在临床上已经显示出很大的应用价值[9]。已有文献报道miR-483-5p参与多种肿瘤的发生和发展,如靶向KCNQ1促进食道癌进展[10],靶向DAPK1降低鼻咽癌细胞的放射敏感性[11],抑制miR-483-5p可抑制三阴性乳腺癌细胞的进展和炎症反应[12]。miR-483-5p在膀胱癌中的作用尚不清楚,本研究旨在探讨miR-483-5p在膀胱癌发生、发展中的作用及其可能的分子机制。

A.miR-483-5p抑制剂的转染效率;B、C.CCK-8实验显示膀胱癌细胞的活力;D～G.EdU实验显示膀胱癌细胞的增殖能力。**P<0.01。

1 材料与方法

1.1 组织样本 本研究收集弋矶山医院泌尿外科就诊患者中30对膀胱癌组织及其对应的正常组织。所有参与者均签署知情同意书,并经皖南医学院弋矶山医院伦理委员会批准。

1.2 细胞培养 人膀胱癌细胞系(EJ和T24)在Gibco公司的RPMI 1640完全培养基中培养,人正常尿路上皮细胞(SV-HUC-1)在F-12K完全培养基中培养。所有细胞系均在37℃、5%CO2培养条件下培养。

1.3 RNA提取和实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR) 本研究采用TRIzol试剂(Invitrogen)从膀胱癌组织和细胞中提取总RNA,然后使用miRNA first-strand cDNA试剂盒将提取的总RNA反转录。接着,使用PrimeScript miRNA RT-PCR试剂盒合成miRNA的互补DNA(complementary DNA,cDNA),并使用2-ΔΔCt方法计算基因的相对表达。miR-483-5p和PTGIS引物均由锐博公司设计。

1.4 泛癌表达分析 为了研究不同类型癌症的RNA表达谱,本研究使用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库(https://portal.gdc.com),该数据库提供了33种肿瘤类型的RNA测序数据(3级)和相关临床信息。

1.5 细胞转染 本研究使用的miR-483-5p抑制剂(inhibitor)和阴性对照(negative control,NC)寡核苷酸购自RiBoBio(中国)。根据说明书,本研究在DMEM培养基中使用Lipofectamine 8000(Beyotime,中国)进行瞬时转染。

1.6 细胞活力、增殖、迁移和侵袭试验 本研究使用BestBio公司的细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)检测细胞的活力。为了评估细胞的增殖能力,在转染48 h后,将低密度的细胞(20 000个细胞/板)接种在96孔板中,然后根据5-乙基-20-脱氧尿苷(5-ethynyl-20-deoxyuridine,EdU)试剂盒(RiboBio,中国)说明书进行下一步实验。在侵袭试验中,将5×104个转染miR-483-5p抑制剂的膀胱癌细胞在涂有Matrigel(BD Bioscience,美国)的上腔中接种,随后在下层补充500 μL含有10% FBS的培养基,并在下层孔中培养24 h。在评估细胞侵袭能力时,在3个随机区域进行细胞计数。

1.7 双荧光素酶报告 基因检测EJ和T24细胞与miR-483-5p模拟物和含有前列环素合成酶(prostacyclin synthase,PTGIS)野生型(Wild-type,wt)或PTGIS突变型(Mutant,mut)3′-UTR的荧光素酶报告载体(GenePharma,中国)通过lipofectamine 8000进行共转染。转染6 h后更换培养基,孵化36 h后裂解细胞。最后检测荧光素酶活性。

1.8 蛋白质印记技术 在细胞中加入含有通用蛋白酶抑制剂(Beyotime,中国)的RIPA缓冲液(Beyotime,中国)。然后,用离心法获得总蛋白,BCA法(Beyotime,中国)测定总蛋白浓度。电泳后,将总蛋白转移到厚度为0.45 mm的PVDF膜上。随后将PVDF膜置于阻断液中1 h,然后将膜与PTGIS(1∶5 000,Abcam,英国)和GAPDH抗体(1∶5 000,Affinity,美国)在4℃下培养过夜。随后,将膜浸泡在二抗(Bosterbio,美国)中1 h。最后使用ChemiDoc Touch系统(Bio-Rad,美国)曝光所有的条带。

2 结果

2.1 miR-483-5p在泛癌中的表达 基于TCGA数据库,本研究评估了miR-483-5p在不同癌症组织中的表达情况。结果显示,在膀胱尿路上皮癌(BLCA)、结肠癌(COAD)、头颈鳞状细胞癌(HNSC)、食管癌(ESCA)、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤(PCPG)以及胃腺癌(STAD)中,miR-483-5p的表达升高(P<0.05,见图1);在乳腺浸润癌(BRCA)、肝细胞肝癌(LIHC)、胆管癌(CHOL)、肾乳头状细胞癌(KIRP)、肾透明细胞癌(KIRC)、肾嫌色细胞癌(KICH)、甲状腺癌(THCA)以及子宫内膜癌(UCEC)中,miR-483-5p的表达下降(P<0.05,见图1)。

2.2 miR-483-5p在膀胱癌组织和细胞中的表达水平 本研究采用qRT-PCR检测了30对膀胱癌样本中miR-483-5p的表达水平,并与相应的癌旁组织进行比较。结果表明,与膀胱癌癌旁组织相比,miR-483-5p的表达升高(t=-4.782,P<0.01;图2A)。与SV-HUC-1细胞相比,EJ和T24细胞中miR-483-5p的表达水平升高(F=23.233,P<0.01;图2B)。

2.3 miR-483-5p在膀胱癌中的诊断价值与预后意义 ROC曲线显示,在预测膀胱癌结局方面,miR-483-5p的预测能力有一定准确性(AUC=0.746,95%CI:0.660～0.833;图3A)。通过Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/)数据库预后价值分析,我们发现高表达miR-483-5p的患者预后更差,miR-483-5p高表达是膀胱癌患者预后的独立危险因素(HR=1.39,95%CI:1.03～1.87,P=0.032;图3B)。

2.4 miR-483-5p的下调抑制了膀胱癌细胞的增殖 我们检测了miR-483-5p抑制剂(miR-483-5p inhibitor)的转染效率,结果显示转染后EJ和T24细胞表达miR-483-5p的水平降低(t=6.059、6.632,P<0.01;图4A)。CCK-8实验结果表明,与miR-483-5p对照(inhibitor NC)组相比,miR-483-5p inhibitor组的EJ和T24细胞活力下降(t=7.593、7.461,P<0.01;图4B、C)。EdU实验表明,与inhibitor NC组相比,miR-483-5p inhibitor组的EJ和T24细胞增殖能力下降(t=7.923、6.694,均P<0.01;图4D～G)。

2.5 miR-483-5p的下调抑制了膀胱癌细胞的迁移和侵袭 划痕实验结果表明,与inhibitor NC组相比,miR-483-5p inhibitor组EJ和T24细胞迁移率下降(t=15.232、11.565,P<0.01;图5A、B)。Transwell侵袭实验显示,与inhibitor NC组相比,miR-483-5p inhibitor组的EJ和T24细胞进入下室的细胞量下降(t=15.384、24.333,P<0.01;图5C、D)。

A、B.划痕实验显示膀胱癌细胞迁移能力;C、D.Transwell侵袭实验显示膀胱癌细胞的侵袭能力。**P<0.01。

2.6 PTGIS是miR-483-5p的靶标 为了寻找miR-483-5p的潜在下游靶标,本研究使用TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)、ENCORI(http://starbase.sysu.edu.cn/)和miRwalk(http://www.ma.uni-heidelberg.de/apps/zmf/miRwalk/)miRNA数据库并与膀胱癌GSE52519数据集中表达下降的基因(P<0.05,logFC<-2)取交集。PTGIS是交集中的一个基因(图6A)。图6B显示了PTGIS mRNA与miR-483-5p的结合位点和突变位点。我们观察到与模拟物-NC(mimics-NC)相比,含有PTGIS-wt的荧光素酶报告载体与miR-483-5p模拟物(miR-483-5p-mimics)共转染会明显降低PTGIS-wt载体的荧光素酶活性,而转染miR-483-5p模拟物后的细胞中含有PTGIS-mut的荧光素酶活性没有受到影响(t=6.797、11.567,P<0.01;图6C、D)。与inhibitor NC组相比,miR-483-5p inhibitor明显提高了EJ和T24细胞中PTGIS mRNA的表达水平(t=12.723、14.747,P<0.01;图6E)。PTGIS蛋白的表达水平在miR-483-5p表达受到抑制后也上升(t=17.537、12.926,P<0.01;图6F)。

A.PTGIS由TargetScan、ENCORI和mirwalk数据库结合GSE52519数据集筛选出来。图中的4个椭圆分别代表TargetScan、ENCORI和mirwalk数据库以及GSE52519数据集的预测结果;B.miR-483-5p与PTGIS结合点的生物信息学预测;C、D.双荧光素酶实验显示,miR-483-5p降低了PTGIS-wt荧光素酶报告基因的荧光素酶活性(**P<0.01);E、F.在被miR-483-5p抑制剂转染的EJ和T24细胞中,PTGIS mRNA(E)和蛋白(F)表达上升(**P<0.01)。

3 讨论

miRNA是一种单链非编码RNA分子,其长度通常为18～25个碱基,通过与基因编码序列或3′非翻译区(3′UTR)结合来调节基因的表达[13]。多项研究表明,miRNA在细胞的增殖、迁移和其他重要的细胞过程中发挥了至关重要的作用[14]。在肿瘤学领域中,因为miRNA被认为是潜在的癌症生物标志物和治疗靶点,所以miRNA一直是研究的热点之一[15-16]。Wang等发现miR-483-5p下调有助于肾透明细胞癌的细胞增殖、转移和炎症[17],Agosta等发现miR-483-5p通过靶向N-myc来促进肾上腺皮质癌中的侵袭性[18]。然而,迄今为止,还未有研究报道miR-483-5p在膀胱癌中的表达与生物学功能。

本研究中,我们进行了生物信息学分析,研究了TCGA数据库中miR-483-5p在泛癌中的表达情况。结果显示,miR-483-5p在6种癌症中的表达升高,而在另外8种癌症中,miR-483-5p的表达下降。这表明miR-483-5p在癌症中可能具有双重作用。已有的多项研究与我们的预测结果一致[10,17,19-20],证明了我们预测结果的可靠性。qRT-PCR检测的结果表明,miR-483-5p在膀胱癌组织和细胞中均高表达,这提示miR-483-5p在膀胱癌中扮演着癌基因的角色。为了探讨miR-483-5p在膀胱癌中的诊断价值和预后意义,我们对miR-483-5p在膀胱癌诊断中的AUC及其表达与膀胱癌患者5年生存率的关系进行了研究。本研究结果表明,miR-483-5p在预测膀胱癌结局方面具有一定的准确性。此外,我们发现miR-483-5p表达水平的升高提示膀胱癌预后不良。这些发现表明miR-483-5p可能成为膀胱癌诊断和预后的重要标志物。我们还进行了体外实验来探究miR-483-5p的生物学功能,结果表明,当miR-483-5p的表达受到抑制时,膀胱癌细胞EJ和T24的增殖、迁移和侵袭显著受到抑制。这表明miR-483-5p在膀胱癌的发展中具有促进作用,并且可能成为肿瘤治疗靶点。

研究发现PTGIS在膀胱癌组织中显著下调,PTGIS过表达可以抑制膀胱癌细胞的增殖和迁移[21]。本研究证实miR-483-5p可以直接靶向PTGIS,并且调节PTGIS mRNA和蛋白的水平。基于这些结果,可以推测miR-483-5p可能通过直接抑制PTGIS的表达在膀胱癌中发挥致癌作用。

综上所述,miR-483-5p在膀胱癌组织和细胞中的表达上调,抑制miR-483-5p可以抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭,miR-483-5p可以负向调节PTGIS。这些发现为膀胱癌的诊断和治疗提供了新的治疗靶点和治疗策略。