68Ga标记四嗪探针68Ga-NOTA-Tz的制备与体内外性质评价

张丰盛，王 撵，宋少莉，杨 红，王明伟

1.复旦大学附属肿瘤医院核医学科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032；

2.上海师范大学化学与材料科学学院，上海 200234；

3.复旦大学生物医学影像研究中心，上海 200032；

4.上海分子影像探针工程技术研究中心，上海 200032

近年来，因为具有优异的选择性和生物正交性、快速的逆电子需求狄尔斯-阿尔德（inverse electron demand Diels-Alder，IEDDA）反应，四嗪（Tetrazine，Tz）/反式环辛烯（transcyclooctene，TCO）体系在肿瘤预靶向正电子发射体层成像（positron emission tomography，PET）/计算机体层成像（computed tomography，CT）领域的应用备受关注［1］。研究［2-3］表明，放射性核素标记Tz探针和TCO修饰抗体的组合体系表现出良好的肿瘤预靶向核素显像效果。在该体系中，核素标记的小分子Tz衍生物发挥探针的作用，是实现肿瘤预靶向核素显像的关键因素之一。为了开展肿瘤预靶向PET/CT或单光子发射计算机体层成像（single-photon emission computed tomography，SPECT）/CT研究，目前已经报道了不同核素标记的Tz探针，例如从111In（t1/2=2.83 d）标记双吡啶Tz衍生物开始［4］，逐渐发展了99mTc（t1/2=6.02 h）［5］、89Zr（t1/2=78.4 h）［6］、64Cu（t1/2=12.7 h）［7］、18F（t1/2=109.8 min）［8-9］和68Ga（t1/2=68.1 min）［10］等核素标记的Tz探针。其中，111In和99mTc适用于SPECT，图像分辨率较低。其他几种用于PET/CT的正电子核素中，89Zr和64Cu的半衰期较长，存在辐射剂量较大、固体靶生产成本较高、可及性较低等局限性。18F是目前使用广泛的核素之一，具有较为合适的半衰期、经济的生产成本和可及性强等优势，然而通常的18F标记温度均较高，在标记过程中可能容易破坏Tz结构而使其失去活性［9，11］。比较而言，68Ga是近几年应用日益增加的金属核素，其半衰期短，辐射剂量较低，由68Ge/68Ga发生器淋洗而得，较易获取，成本较低，灵活性大，并且采用螯合方式标记68Ga，反应条件温和，标记率高［12-13］。因此，68Ga标记Tz探针是引人关注的核素标记Tz衍生物之一，在基于Tz/TCO体系的肿瘤预靶向显像领域具有很大的发展潜力。

为了探索68Ga标记Tz探针在基于Tz/TCO体系的肿瘤预靶向PET/CT应用的可行性，本文选择Tz探针68Ga-NOTA-Tz为对象，开展其放射性标记条件优化和包括稳定性、生物分布和肿瘤MicroPET/CT在内的体内外性质评价研究，为68Ga标记Tz衍生物的体内生物正交点击反应策略的应用提供直观的实验参考。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

采用德国Siemens公司的Inveon小动物MicroPET/CT机；德国Isotope Technologies Garching公司的68Ge/68Ga发生器；美国Agilent公司的液相色谱仪1260 Infinity，配有可变波长紫外检测器、放射性检测器（德国Raytest公司）和PLRP-S分析柱（5 μm，300 Å，250.0 mm×4.6 mm）；挪威Biosan公司的TS-100金属浴振荡器；德国Sigma公司的3-30K冷冻离心机；德国Sartorius公司的BSA124S精密天平；德国Raytest公司的MiniGita Star放射性薄层色谱扫描仪；上海核所日环光电仪器有限公司的SN-6110γ放射性免疫计数仪。

1.1.2 试剂核素68Ga来自于68Ge/68Ga发生器，NOTATz为西安点化生物科技有限公司产品，浓盐酸（36%～38%）购自国药集团化学试剂有限公司，无水乙酸钠（≥99.0%）购自上海泰坦科技股份有限公司，磷酸盐缓冲生理盐水（phosphate buffer saline，PBS）购自上海碧云天生物技术有限公司，iTLC-SG层析纸购自美国Agilent Technologies公司，甲醇（99.5%）购自上海化学试剂有限公司，乙酸铵（AR）购自阿拉丁试剂有限公司，HPLC/光谱纯乙腈购自美国Tedia公司。

1.1.3 肿瘤细胞和模型

SMMC-7721人肝癌细胞系购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库/中国中科院上海生命科学研究院细胞资源中心，使用含10%胎牛血清（FBS，Gibco）、1%青霉素和链霉素的DMEM培养基，在37 ℃、CO2体积分数为5%潮湿环境下培养。5周龄BALB/c正常小鼠（雄性）和BALB/c裸小鼠（雄性）均购自上海灵畅生物科技有限公司。消化离心处理处于对数生长期的SMMC-7721细胞，用PBS配制成细胞悬液。取0.1 mL（1×107个细胞）细胞悬液，注射到裸小鼠左前肢腋窝皮下，待肿瘤生长至0.5～1.0 cm时用于动物实验。

1.2 68Ga-NOTA-Tz的放射性标记条件优化

68Ga-NOTA-Tz的放射化学标记路线如图1所示。为了优化其标记条件，本文针对反应体系的pH值、温度、时间和前体用量等影响因素，设计了一系列平行实验。

图1 68Ga-NOTA-Tz的放射化学标记路线示意图

首先用5.0 mL HCl（0.05 mol/L）淋洗68Ge/68Ga发生器，收集中间2.0 mL68Ga淋洗液。然后，对于平行的多组反应，取多个反应管，分别向其中加入100 µL68Ga淋洗液、一定量醋酸钠溶液（0.5 mol/L，调节反应体系的pH值）、一定量的NOTA-Tz水溶液（5 mmol/L），混合均匀，置于金属恒温振荡仪中，加热一定时间，进行68Ga标记反应。达到反应时间后，停止加热，取样点板，用放射性薄层色谱仪分析标记率，展开剂为醋酸铵溶液（1.0 mol/L）/甲醇（体积比1∶1）混合液。

1.3 68Ga-NOTA-Tz的放射化学纯度分析

为了分析68Ga-NOTA-Tz的放射化学纯度，本文采用了Radio-iTLC和Radio-HPLC两种方法。对于Radio-iTLC分析，采用iTLC层析纸，展开剂为醋酸铵溶液（1.0 mol/L）/甲醇（体积比1∶1）混合液。对于Radio-HPLC分析，采用梯度分析方式，流动相为水（含0.1%TFA，A）和乙腈（含0.1%TFA，B）混合液。其浓度变化梯度：0～5 min为100%A+0%B，5～10 min为75%A+25%B，10～17 min为33%A+67%B，17～20 min为0%A+100%B，流速为1.0 mL/min，紫外检测波长为254 nm。

1.4 体外稳定性

取100 μL68Ga-NOTA-Tz溶液，分别加入等体积的生理盐水和FBS，37℃恒温温育0.5、1.0、2.0、4.0 h。在每个时间点取样点板，进行RadioiTLC分析，测定放射化学纯度。

1.5 血浆蛋白结合率

取新鲜小鼠血液，置于抗凝管内，静置1.0 h后，冷冻离心分离（4 000 r/min，5 min），取上层血浆。取100 μL68Ga-NOTA-Tz溶液（2.0 μCi，1 μCi=3.7×104Bq）和100 μL血浆混匀，于37 ℃恒温温育0.5、1.0、1.5 h。在每个时间点，超滤离心分离（15 000 r/min，10 min），再用PBS清洗，重复3次。分离后，用γ计数仪分别测量滤膜上和滤液中的放射性，计算血浆蛋白结合率。

1.6 脂水分配系数

取1.0 mL水和1.0 mL正辛醇混合均匀，置于5.0 mL离心管内（n=5），再加入68Ga-NOTA-Tz溶液（2.0 μCi），充分混合摇匀，静置。待混合液完全分层后，分别取100 μL水相和100 μL有机相，用γ计数仪分别测量水相与有机相的放射性，计算脂水分配系数logP。

1.7 血液半衰期

通过尾静脉，将68Ga-NOTA-Tz溶液（30 μCi，200 μL）注射到小鼠体内（n=5），于注射后1、3、5、10、15、30、60、90 min取血，称重，用γ计数仪测量血液放射性，计算每克血液百分注射剂量率（%ID/g）。通过GraphPad拟合，计算早期快速分布半衰期和终末缓慢清除半衰期。

1.8 正常鼠生物分布

通过尾静脉，将68Ga-NOTA-Tz溶液（40 μCi，200 μL）注射到正常BALB/c小鼠体内（n=3）。于注射后5、15、30、60、90 min取血，然后用脱颈方式处死小鼠，解剖并获取心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、膀胱、肌肉、血液、脑和骨等，称重，用γ计数仪测量组织放射性，计算各组织% ID/g。

1.9 移植瘤模型MicroPET/CT

通过尾静脉，将68Ga-NOTA-Tz溶液（100 μCi，100 μL）注射到SMMC-7721移植瘤模型小鼠体内（n=3）。于注射后0.5、1.0、1.5 h，使用异氟烷气体麻醉荷瘤小鼠，进行MicroPET/CT显像，先行CT扫描5 min，再行PET扫描10 min。经Inveon软件重建，获得MicroPET/CT图像，勾画感兴区，计算肿瘤、心、胆囊和肾脏等主要器官%ID/g。

1.10 统计学处理

采用SPSS 26软件分析处理数据。研究数据以±s表示，P＜0.05为差异有统计学意义，

2 结 果

2.1 68Ga-NOTA-Tz的优化标记条件

2.1.1 反应体系pH值对标记率的影响

取0.1 mL68Ga淋洗液，分别添加19、22、25、28 μL乙酸钠溶液（0.5 mol/L），调节pH值为3.8、4.1、4.4、4.6，再加入3.0 μL NOTA-Tz溶液（5.0 m mol/L），在25 ℃反应10 min。反应体系pH值对标记率的影响如图2A所示，pH=3.8时标记率最高，接近60%，而pH=4.1、4.4和4.6时标记率均有不同程度的下降。因此，68Ga-NOTATz的优化的标记pH值为3.8。

图2 不同反应条件对标记率的影响

2.1.2 反应温度对标记率的影响

选择上述优化的pH值，68Ga淋洗液和NOTATz的用量同2.1.1，分别在25、37和45 ℃反应10 min。反应温度对标记率的影响如图2B所示，25℃时标记率只有55%，37℃时为71%，45℃时达到84%。由此可见，68Ga-NOTA-Tz的标记率随反应温度的升高而升高，并且3个反应温度之间的标记率差异有统计学意义（P＜0.05）。因此，综合考虑Tz结构的热稳定性和标记率，优化的标记温度为45 ℃。

2.1.3 反应时间对标记率的影响

选择上述优化的标记pH值和温度，68Ga淋洗液和NOTA-Tz的用量同2.1.1，分别在45 ℃反应10、15、20 min。反应时间对标记率的影响如图2C所示，反应时间为10 min时标记率已经达到91%，而随着时间延长，标记率并没有明显变化。因此，综合考虑标记率和68Ga的衰变，优化的标记反应时间是10 min。

2.1.4 前体用量对标记率的影响

选择上述优化的标记pH值、温度和时间，68Ga淋洗液的用量同2.1.1，分别加入1.0、2.0、3.0 μL的NOTA-Tz溶液（5.0 mmol/L），在45 ℃恒温反应10 min。前体用量对标记率的影响如图2D所示，前体用量5.0 nmol时标记率为81%，而10.0和15.0 nmol时分别为79%和74%，即增加前体投料并不是提高标记率的有利因素。综合考虑标记率和节约前体用量，优化的标记前体用量为5.0 nmol。

2.2 68Ga-NOTA-Tz的制备和放射化学纯度分析

如图3所示，采用上述优化标记条件制备68Ga-NOTA-Tz，其标记率大于95%。经RadioiTLC和Radio-HPLC分析，68Ga-NOTA-Tz的放射化学纯度大于95%，无需额外的纯化，可以直接用于后续实验。

图3 68Ga-NOTA-Tz的平均标记率和放化纯度分析

2.3 68Ga-NOTA-Tz的体外性质评价

图4A是68Ga-NOTA-Tz的体外稳定性曲线，4.0 h内其在生理盐水和FBS中的稳定性分别保持在95%和90%以上。这表明68Ga-NOTA-Tz具有良好的体外稳定性，有利于后续的体内显像。68Ga-NOTA-Tz的脂水分配系数logP为-2.06±0.02，说明其亲水性较好。68Ga-NOTA-Tz与血浆蛋白结合率如图4B所示，在0.5、1.0、1.5 h时均处在20%～25%，显示其具有一定的血浆蛋白结合能力。

图4 68Ga-NOTA-Tz的体外性质

2.4 68Ga-NOTA-Tz的血液半衰期和体内生物分布

根据其血液放射性活度-时间曲线计算可知，68Ga-NOTA-Tz在小鼠体内的早期快速分布即生物分布半衰期为1.1 min，终末缓慢清除即血液清除半衰期为29.1 min。这说明68Ga-NOTA-Tz在动物体内呈现快速的分布和代谢特征，具有良好的药物代谢动力学性质。

68Ga-NOTA-Tz的正常动物体内生物分布如表1所示。注射后5 min，68Ga-NOTA-Tz在心、脾、肺、肾、胃、膀胱、肌肉等大多数主要组织中的%ID/g均达到最大值，然后逐渐降低。然而，肝脏%ID/g直到注射后30 min才达最大值，之后才随时间延长而减少。比较主要脏器%ID/g的高低可知，在所有的时间点肾脏%ID/g均最高，其次是肝脏、膀胱，表明68Ga-NOTA-Tz的主要排泄途径是泌尿系统，其次是肝胆系统，这符合该探针亲水性较强的性质。同时，相对而言，在注射后每个时间点68Ga-NOTA-Tz的血液%ID/g均较高，并且降低较为缓慢，这可能与其具有一定程度的血浆蛋白结合率有关。因此，68Ga-NOTA-Tz的体内行为表现出全身主要器官均有较高的快速分布、通过泌尿和肝胆系统排泄、血液清除慢而本底高的特点。

表1 68Ga-NOTA-Tz的正常动物体内生物分布

2.5 68Ga-NOTA-Tz的肿瘤MicroPET/CT

为了更加直观且整体地观察68Ga-NOTA-Tz的全身分布情况，本文开展了注射后不同时间点68Ga-NOTA-Tz的SMMC-7721荷瘤小鼠MircoPET/CT显像（图5）。由图可知，肝、胆、肾脏和膀胱等主要脏器在注射后各个时间点均有很强的放射性信号，与上述正常鼠生物分布的结果基本一致，这进一步表明68Ga-NOTA-Tz经过泌尿系统和肝胆系统排泄。特别重要的是，68Ga-NOTA-Tz的肿瘤显像信号明显，具有一定的对比度，能够区别周围正常组织，在注射后0.5、1.0、1.5 h时%ID/gmean分别为1.6±0.11、1.3±0.15和1.3±0.12，表明68Ga-NOTA-Tz能快速分布并长时间滞留于肿瘤组织内，这有利于其在基于体内生物正交点击反应的肿瘤预靶向PET/CT领域的应用。

图5 68Ga-NOTA-Tz的SMMC-7721荷瘤鼠模型MircoPET/CT显像和分析

3 讨 论

为了推动基于Tz/TCO体系的生物正交点击化学的肿瘤预靶向显像策略的基础和临床转化研究，核素标记Tz探针的研发是非常重要的环节之一。此类探针的选择需要考虑核素的类型与Tz结构等两个重要方面，其中核素决定了半衰期、辐射剂量和显像模式，而Tz结构影响其生物正交点击反应活性和稳定性，最终关系到其水溶性、血液半衰期、生物分布、肿瘤滞留等重要的生物学性质［14-15］。在综合考虑各种因素的基础上，本文选择研发Tz探针68Ga-NOTA-Tz，开展其放射性标记条件优化和体内外性质评价研究，为68Ga标记Tz探针的生物正交点击反应策略的体内应用提供直观的实验参考。

制备68Ga标记探针的常用方法是通过NOTA等双功能螯合剂的螯合方式标记68Ga，其标记条件温和、反应时间短及标记率高。然而，这种68Ga标记方法对反应体系的pH和温度等标记条件较为敏感。因此，为了优化建立68Ga-NOTA-Tz的可靠制备方法，本文首先探讨了pH值、温度、时间和前体用量等4个主要影响标记率的条件实验。优化实验结果显示，在反应体系pH=3.8、反应温度45℃、反应时间10 min、前体用量5 nmol等条件下，标记率大于95%，无需进一步分离纯化，实现了68Ga-NOTA-Tz的稳定可靠制备，为后续的性质评价和应用提供了保证。

研究［15-16］表明，Tz探针的亲水性、药代动力学、代谢等生化性质会影响其在肿瘤内与TCO点击反应，并将最终决定肿瘤预靶向显像效果。由此，本文接下来开展了68Ga-NOTA-Tz的体内外性质评价研究。体内外实验结果显示，68Ga-NOTA-Tz不但具有良好的体外稳定性和亲水性，而且有适合的生物半衰期，可保证充分的体内循环时间来增加与TCO点击反应。生物分布和SMMC-7721细胞小鼠移植瘤MircoPET/CT显示，68Ga-NOTA-Tz虽然主要分布在肝脏、胆囊、肾脏和膀胱等主要代谢器官，但是也能快速而均匀地分布至肿瘤组织，表明其应用于基于体内生物正交点击反应的肿瘤预靶向PET/CT显像的潜力。

综上所述，本文通过优化Tz探针68Ga-NOTATz的放射性标记条件，建立了其标记率高、稳定可靠的制备方法，并发现其具有良好的稳定性和亲水性以及快速而均匀的肿瘤分布，显示出基于体内生物正交点击反应的肿瘤预靶向PET/CT显像的应用潜力。