基于ICP-MS及多元统计分析相结合的地黄酵素发酵前后无机元素特征

何江龙 裴莉昕 张童童 纪宝玉 娄玉霞 陈随清 董诚明

(河南中医药大学 药学院 郑州 450046)

随着居民生活水平的提高和保健意识的增强,人们对健康越来越重视,植物性中药及其制品也受到人们的广泛关注和青睐,成为目前保健品市场上备受关注的一类产品。近年来,人们更加注重食品安全问题,同时又追求天然植物性原料产品,这些因素使得一些纯天然的绿色食品受到欢迎[1]。在食品加工领域,越来越多的学者关注到这一新型保健食品的功能,国内外也都非常重视中药的开发利用,特别是在食品领域功能性产品的开发[2],中药保健食品行业也迎来了蓬勃的发展。

中药成分复杂,含有多种化学成分,具有丰富的营养价值和独特的药理生理等活性[3],这些有效成分对人的生命健康起着至关重要的作用[4],同时也为保健食品的开发提供了新材料,因而被广泛开发成各种保健品。随着保健食品方面的需求不断增加,作为传统中药之一的地黄也开始逐渐进入大众视野,其保健作用已被人们所接受[5]。地黄为玄参科植物地黄RehmanniaglutinosaLibosch.的新鲜或干燥块根,具清热凉血、滋阴生津等功效[6]。地黄酵素是以地黄药材为原料,利用微生物发酵技术制备的一种具有多种生物活性的植物多酚物质,它能促进机体内各种酶系和新陈代谢系统活动,具有一定的抗氧化作用。

中药发酵是借助微生物的生长代谢作用,在适当的条件下对中药进行发酵,促进有效成分的溶出和成分的转化,改变其原有的特性,增强并产生新的药效[7]。无机元素广泛存在于植物中,也是中药产生临床疗效的重要物质基础[8-9],无机元素的测定方法主要有原子吸收光谱法、原子荧光光谱法、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)等,由于ICP-MS具有准确度高、精密度好、抗干扰能力强、检测限低等优点,已经广泛应用于天然产物研究领域[10-12]。目前关于发酵对中药影响的研究多集中于化学成分及药理作用等方面,而对发酵前后无机元素的影响鲜有报道。为了进一步探讨地黄酵素制备过程中无机元素的变化,本研究以不同来源的地黄为原料,利用ICP-MS结合多元统计学方法对地黄酵素发酵前后样品中的无机元素含量变化特征进行分析,为地黄酵素在功能性食品添加剂方面的研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验样品

地黄样品共4批,产地分别为河南焦作沁阳(S1)、河南焦作沁阳保存45 d(S2)、河南焦作温县(S3)、河南许昌鄢陵(S4)。地黄酵素发酵前样品由4批地黄样品用水提取后烘干制得,命名为ST1-ST4;地黄酵素由4批地黄样品用水提取后经乳酸菌及酵母菌发酵、烘干后制得,命名为SF1-SF4。

1.2 仪器设备

ICAP RO电感耦合高频等离子体质谱仪(Thermo Fisher Scientific公司)、MARS 2微波消解仪(培安·CEM微波化学技术中心)、GS25石墨赶酸仪(成都奥普乐有限公司)、FA2004N电子天平(上海民桥精密科学仪器有限公司)、DZF-6021真空干燥箱(上海一恒科学技术有限公司)。

1.3 试剂及标准溶液

Al、As、B、Ba、Cd、Co、Cr、Cu、Fe、Hg、Mn、Mo、Ni、P、Pb、Se、Sn、Sr、Ti、Tl、V、Zn多元素混合标准储备溶液(100 μg/mL,介质为15%HCl、5%HNO3,国家有色金属及电子材料分析测试中心),Na、K、Ca、Mg混合标准储备溶液(1 000 mg/L,介质为5%HNO3,上海源叶生物科技有限公司),Bi、Ge、In、Li内标储备溶液(100 μg/mL,介质为10%HNO3,Agilent Technologies公司),Ba、Bi、Ce、Co、In、Li、U质谱调谐液(1.00 μg/L,以2%HNO3、0.5%HCl为介质,Thermo Fisher Scientific公司)。硝酸(上海安谱实验科技有限公司),实验用水为蒸馏去离子水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 样品制备

将鲜地黄切片烘干后破碎成粉,以1∶40的料液比超声水提,不经乳酸菌和酵母菌发酵,离心,浓缩,烘干成粉,得到地黄未发酵样品。将鲜地黄切片烘干后破碎成粉,以1∶40的料液比超声水提,后经乳酸菌和酵母菌发酵86 h后离心,将发酵液浓缩,烘干,研磨成粉,得到地黄酵素。

1.4.2 标准溶液及内标溶液的配制

使用5%的HNO3溶液将100 μg/mL多元素混合标准储备溶液稀释为0.02、0.10、0.50、1.00、2.00、4.00、10.00、20.00、100.00、250.00 μg/L的混合标准梯度溶液,将1 000 mg/L的碱金属混合标准储备溶液稀释成0.01、0.05、0.25、0.50、1.00、1.25、2.50、5.00、10.00、12.50、25.00、50.00、100.00 mg/L的混合碱金属标准梯度溶液,将100 μg/mL内标储备溶液稀释成10 μg/L,现用现配。

1.4.3 供试品溶液制备

准确称取每种样品0.20 g(精确至0.000 1 g)于微波消解罐中,以不加样品作空白对照,分别向消解罐中加入6 mL HNO3,轻轻摇动使样品散开,在120 ℃条件下预消解15 min,冷却至30 ℃左右,旋紧罐盖放入微波消解仪中,消解至溶液呈无色透明或浅黄色,打开罐盖,排气,将消解罐置于赶酸仪中,130 ℃下赶酸6 h至1～2 mL,透明无残渣状态,放冷后将消解液转移,并用少量去离子水将消解罐洗涤3次,合并洗涤液与消解液定容至50 mL,混匀备用。检测前使用去离子水稀释50倍。

1.4.4 微波消解程序的设置

第一阶段:爬坡温度100 ℃,时间8 min,保持5 min;第二阶段:爬坡温度150 ℃,时间5 min,保持5 min;第三阶段:爬坡温度170 ℃,时间2 min,保持10 min;第四阶段:爬坡温度190 ℃,时间2 min,保持30 min后冷却至室温。

1.4.5 ICP-MS工作条件

ICP-MS工作条件见表1。

表1 ICP-MS工作参数Table 1 ICP-MS working parameters

1.4.6 方法学验证

1)线性范围考察:取上述配制的系列混合标准工作液,按设定的参数测定,以各元素的质量浓度为横坐标、各元素经内标校正的信号值为纵坐标绘制标准曲线,计算线性回归方程并获得相关系数。

2)检出限:以样品空白溶液连续测定6次所产生信号响应标准差的3倍所对应的待测元素浓度表示检出限。

3)精密度:准确称取同一样品1份,按实验方法制备样品溶液,重复进样6次,测定并计算其中各元素的含量,计算测定值的相对标准偏差。

1.4.7 样品中无机元素的含量测定

取适量地黄粉末,按实验方法分别制备地黄发酵前后的样品和相应的供试品溶液,再按实验方法分别进样测定24种无机元素的含量,每份样品平行测定3次,并按标准曲线外标法计算其含量。

1.4.8 数据统计与分析

统计数据采用SPSS 26软件进行t检验分析,取P<0.05为显著性。利用ChiPlot软件对24种元素进行相关性分析,根据Pearson相关系数判断不同元素之间的相关性。

2 结果与分析

2.1 ICP-MS测定地黄酵素发酵前后无机元素的方法学验证

24种无机元素线性范围、线性方程、相关系数及检出限等结果列于表2,结果表明,24种元素的标准溶液在测定范围内均具有良好的线性关系,相关系数均在0.998以上,可满足检测要求。精密度测定值的相对标准偏差为0.13%～4.1%,表明该仪器精密性良好,满足实验要求。重复性测定值的相对标准偏差为0.47%～5.0%,表明该方法重复性良好。

表2 ICP-MS测定地黄酵素发酵前后方法学验证结果Table 2 Results of methodology verification before and after rehmannia fermentation determined by ICP-MS

2.2 地黄酵素发酵前后无机元素的含量分析

发酵液和原液中的无机元素来源大致可以分为三类:原料、微生物与发酵环境(生产设备、用水、空气等)的引入[13]。其中,地黄原料及发酵环境是发酵中金属无机元素的主要来源。地黄酵素以地黄为主要原料,这些原料在生长过程中一方面吸收了土壤中含有无机元素的肥料,另一方面也富集了土壤中污染的无机元素,因此地黄原料中无机元素的特点在一定程度上反映了地黄产地的土壤特征,也决定了地黄酵素无机元素的含量和组成。地黄酵素发酵前后无机元素的含量测定结果(表3)表明,除个别元素外,24种无机元素均可以在地黄酵素发酵前后的样品中检测到,但是四个产地的地黄相应样品中无机元素的含量差异较大。另外,地黄酵素发酵前后样品中无机元素的含量特征也存在差异,发酵前含量较高的元素为K、Ca、Na、P、Mg,这几种元素与植物生长必须的元素相一致,其次为Fe、Pb、Al、Sr、Ti、Ba、B、Se、Mn、Zn、Cu等,其含量在2.77～28.19 mg/kg,其余8种元素的含量均较低,其中Cd、Co、V三种元素的平均含量均低于0.1 mg/kg;发酵后含量较高的元素为K、Na、Ca、Mg、P,其次为Fe、Al、Pb、Mn、Sr、B、Se、Ba、Ti、Zn等,其含量在3.56～34.66 mg/kg,其余9种元素的含量均较低,其中Cd、Co、Ni三种元素的平均含量均低于0.1 mg/kg。比较发酵前和发酵后地黄液中对应24种无机元素的平均含量,可以看出,发酵前Mg、P、K、Ca、Ti、V、Cr、Ni、Cu、As、Mo、Sn、Ba和Pb元素含量高于发酵后,而发酵后B、Na、Al、Mn、Fe、Co、Zn、Se、Sr和Cd元素则高于发酵前。以上结果表明,地黄酵素发酵前后,虽然含量较高的元素种类基本没有发生变化,但各元素的含量在发酵前后却发生了变化,因此发酵对地黄原料中无机元素的种类没有影响,但对无机元素的含量影响较大。

表3 地黄酵素发酵前后样品中无机元素含量测定结果Table 3 Determination results of inorganic elements in samples before and after rehmannia fermentation /(mg·kg-1)

2.3 地黄酵素发酵前后无机元素含量的差异性分析

为了进一步探讨地黄酵素发酵前后无机元素的差异性规律,利用SPSS统计学软件,采用最大方差旋转法对24种元素在地黄酵素发酵前后样本中的组成进行因子分析。图1为各元素在主成份因子分析所提取的前三个主成分上的载荷所绘制的三维因子分布图,各元素的对应载荷值差异反映了其在相应主成分上的相似性,在三维因子分布图上越靠近,表明这些元素相似程度越高[14]。从各元素在发酵前地黄溶液中的因子载荷分布在因素1和因素2(这两个主成分对因子分析的贡献率最高)组成的平面上的投影可以看出,在发酵前的地黄酵素样品中24种元素大致可以分为三组:Al、Cd、Co和Se等4种元素为第一组,P、Ni、Ti、Ca和Pb等5种元素为第二组,剩余15种元素为第三组。发酵后的地黄酵素样品中的各元素组成同样可以分为三组:第一组为Na、Ca、Sn、Cr、Cu、V、Mn、Ni、Ba、Mo和K 等11种元素,第二组为Co、Pb、B、Al和Ti等4种元素,剩余6种元素则为第三组。比较分析发酵前后地黄酵素样品中各簇元素组成特点发现,尽管各元素的相对含量排序在两组样品中基本相同,但在发酵前后24种元素的分类特征却明显不同,这表明根据因子分析结果的多元素分组并不完全依赖各元素的含量高低。

图1 地黄酵素发酵前(a)及发酵后(b)24种无机元素的因子载荷分布图Figure 1 Factor loading distribution of 24 inorganic elements before(a)and after(b)rehmannia fermentation.

地黄酵素发酵前后样品中24种无机元素的因子载荷分析表明,两种样品的无机元素在组成特征上存在差异,为了进一步寻找引起差异的无机元素,利用发酵前后4个样品24种无机元素的平均含量作为分析对象,使用SPSS软件的配对t检验法对发酵前后样品中无机元素的差异性进行检验(表4)。结果表明,地黄提取液经过发酵后,Na、P、Mn、Se、Sr和Cd等6种元素的含量差异在统计学上达显著水平(p<0.05),尽管发酵后地黄液中B、Al、Fe、Co和Zn元素含量高于发酵前样品,但是两者之间的含量差异并未达到显著水平。

表4 地黄酵素发酵前后样品中各无机元素平均含量的配对t检验结果Table 4 Paired t-test results of average contents of inorganic elements in samples before and after rehmannia fermentation

2.4 地黄酵素发酵过程中无机元素变化趋势的相关性分析

相关性分析是对两个或多个变量进行分析,从而衡量两个变量因素的相关密切程度[10]。地黄酵素发酵前后无机元素含量分析表明,地黄发酵过程中无机元素发生了不同的变化过程,为了分析地黄酵素发酵过程中24种无机元素之间的变化关系,将24种元素在发酵过程中的变化趋势进行Pearson相关性分析(图2)。相关性分析结果表明,Ca和Ti、Ni,As和Zn、Cr,Al和B的变化趋势存在极显著的正相关关系,Pearson相关系数在0.90以上,其中,Ca和Ti之间的Pearson相关系数达到0.97;Ti和Ni,Cr和Ba、Sn,Se和Sr、Cd,Na和Mn存在显著的正相关关系,Pearson相关系数在0.80以上;而P和Mn,Ba和Pb存在显著的负相关关系,Pearson相关系数在-0.80以下。因此,地黄酵素发酵过程中各无机元素之间的代谢相互影响。

图2 地黄汁发酵前后各元素之间相关性的Pearson 分析系数Figure 2 Pearson analysis coefficient for the correlation between elements before and after fermentation of rehmannia juice.

3 讨论

Ca和P是植物生长所必须的元素,Ca被植物吸收后,大部分与生物配体结合后以配合物的形式存在,依据Ca是否与配体结合,将Ca的存在形式分为自由离子态和结合态两种,而P元素在植物体内则主要是以植酸磷的形式存在,结合态的Ca和植酸磷溶解度较差。本研究发现,经过发酵制备的地黄酵素中Ca和P含量均降低,其中P降低比较明显,这可能由于在地黄酵素的制备过程中,在微生物的作用下产生一些可以与游离态Ca和P结合的化学成分,导致溶液中游离态元素的含量降低。另外,发酵后Na含量明显增加,这可能是经乳酸菌和酵母发酵后地黄内的Na以离子态释放到提取液中,使得地黄酵素Na的含量升高。Pb、As、Cr和Cd等元素常被视为食品中的有害元素,其浓度超标可能带来健康威胁,通过对四批地黄提取物和地黄酵素中As、Cr、Cd、Pb等4种有害元素进行检测,发现产地和发酵过程影响4种有害元素的含量,发酵可使地黄中部分有害元素As、Cr、Pb含量降低,发酵后Cd元素含量虽有所上升,但符合《食品安全国家标准》GB 2762—2017中食品中污染物的限量规定。

4 结论

本研究利用微波消解-电感耦合等离子体质谱法对地黄酵素发酵前后样品中24种无机元素的含量进行测定,结果表明采用微波消解法对地黄酵素实际样品进行前处理,可以实现批量处理,操作简便快速,试剂用量少,消解效果好,具有较好的稳定性和准确性,可以应用于地黄酵素样品中无机元素的含量测定,该研究为地黄酵素在功能性食品添加剂方面的研究和地黄酵素的制备开发提供数据支撑,同时为其他中草药功能性保健食品中无机元素的检测提供方法参考。

在研究中发现,在地黄酵素的发酵过程中由于微生物的引入、生长和迁移,以及发酵代谢产物的生成、扩散和转移,部分无机元素的存在状态可能会随着发酵的进行而发生变化,但具体的变化机理还有待于进一步研究。