2型糖尿病患者血清miR-146a与糖尿病肾病相关性研究

徐成高，罗丽君

2型糖尿病患者血清miR-146a与糖尿病肾病相关性研究

徐成高1，罗丽君2

1.嘉兴市第一医院内分泌科，浙江嘉兴 314000；2.嘉兴市第一医院儿科，浙江嘉兴 314000

探讨2型糖尿病患者血清miR-146a及肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）与糖尿病肾病的关系。收集2020年12月至2022年1月嘉兴市第一医院内分泌科收治的128例2型糖尿病患者，根据尿白蛋白与尿肌酐比值（urinary albumin-to-creatinine ratio，UACR）将患者分为3组：尿白蛋白正常组（UACR<30mg/g，58例）；微量尿白蛋白组（30mg/g≤UACR<300mg/g，44例）；大量尿白蛋白组（UACR≥300mg/g，26例）。收集患者的基线资料，采用实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）检测血清miR-146a的表达水平，酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测血清TNF-α的表达水平。分析miR-146a及TNF-α与UACR的关系。与尿白蛋白正常组相比，微量尿白蛋白组和大量尿白蛋白组患者的TNF-α水平均明显升高，且随尿蛋白升高递增，差异有统计学意义（<0.05）。微量尿白蛋白组和大量尿白蛋白组患者的miR-146a水平均低于尿白蛋白正常组，差异有统计学意义（<0.05）。Spearman相关分析显示，miR-146a与UACR呈负相关（=–0.574，<0.05），TNF-α与UACR呈正相关（=0.824，<0.05）。miR-146a预测糖尿病肾病的敏感度为77.1%，特异性为79.3%（95%：71.7%～87.4%，<0.05）。2型糖尿病患者血清miR-146a及TNF-α可作为预测糖尿病肾病的分子学标志物，有助于糖尿病肾病的早期诊断。

2型糖尿病肾病；miR-146a；TNF-α

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病患者中常见的慢性微血管并发症。研究报道，在糖尿病病程15年以上人群中，终末期肾病（end-stage renal disease，ESRD）发病率超过20/1000人年，DN是目前引起ESRD的首要原因[1]。目前我国DN的发病率呈不断上升趋势，住院患者中有40%的2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者罹患有DN。目前研究表明，DN的风险因素包括高龄、男性、种族、长病程、高血糖、高血压、肥胖（尤其是腹型肥胖）、高盐饮食、血脂异常、肾毒物质、急性肾损伤、蛋白摄入过多等，然而T2DM患者DN的具体发病机制仍不完全清楚[2-3]。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一类内源性非编码RNA分子。miR-146a是与炎症反应密切关联的miRNA，其作为调控因子可参与天然免疫，其影响细胞代谢主要是通过影响核转录因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）相关通路的靶基因调控炎症反应实现[4]。研究发现，T2DM患者血清miR-146a水平较健康者普遍降低，miR-146a表达水平降低与T2DM的易感性有关[5]。另有研究表明，T2DM合并周围神经病变组中，miR-146a表达水平明显低于T2DM组，并证明miR-146a不依赖血糖水平在糖尿病周围神经病变中发挥重要作用[6]。在动物实验中发现，miR-146a靶向肿瘤坏死因子受体相关因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6）调节白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎症因子的分泌，糖尿病小鼠血清中miR-146a水平下调，促进了炎症的活化及肾脏纤维化基因的表达[7]。目前miR-146a与DN的研究报道较少，因而本研究为探讨miR-146a与T2DM患者DN的关系，通过对2020年12月至2022年1月嘉兴市第一医院内分泌科收治的128例T2DM患者的临床资料进行回顾，根据DN的临床诊断指标UACR的不同分组分析，探讨miR-146a对DN的早期诊断价值，以对诊治DN提供重要参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2020年12月至2022年1月嘉兴市第一医院内分泌科收治的128例T2DM患者。纳入标准：①年龄为18～70岁；②参照1999年WHO发布的《2型糖尿病诊断标准》；③未服用增加或减少尿白蛋白的药物，如血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体拮抗剂和钠–葡萄糖协同转运蛋白2（sodium- dependent glucose transporters 2，SGLT-2）抑制剂；④临床资料相对完整。排除标准：①其他原发或继发肾脏疾病；②严重心脏疾病、血液病、肿瘤疾病；③感染性疾病；④未控制的高血压等。根据尿白蛋白/肌酐比值（urinary albumin-to-creatinine ratio，UACR）将患者分为3组：尿白蛋白正常组（UACR<30mg/g，58例）；微量尿白蛋白组（30mg/g≤UACR<300mg/g，44例）；大量尿白蛋白组（UACR≥300mg/g，26例）。本研究征得患者的知情同意，并经嘉兴市第一医院伦理委员会审核批准（伦理审批号：LS2018-192）。

1.2 方法

1.2.1 收集基线资料 包括患者的性别、年龄、病程、吸烟史、收缩压、舒张压、体质量、身高。

1.2.2 实验室指标测定 采集患者清晨空腹静脉血，采用全自动生化仪电化学发光法测定甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、肌酐、尿素氮、空腹血糖水平。化学发光法测定空腹胰岛素、维生素D水平，高压液相色谱法测定糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin，HbA1c）水平，留取晨尿采用免疫投射比浊法测定UACR。稳态模型评估的胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment insulin resistance index，HOMA-IR）=胰岛素（mIU/L）×葡萄糖（mmol/L）/22.5。

1.2.3 血清TNF-α的测定 收集患者血液标本，3000r/min（离心半径10cm）离心10min，分离取上清，置于–80℃冰箱保存。采用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测血清TNF-α的表达水平。选择DENLEY DRAGON Wellscan MK 3酶标仪（美国Thermo公司）在450nm处测定吸光度，根据标准曲线，计算TNF-α的浓度。

1.2.4 miR-146a的测定 收集患者血液标本，3000r/min（离心半径10cm）离心10min，分离取上清，置于–80℃冰箱保存。采用Trizol提取miRNA，采用miRNA反转录试剂盒合成cDNA，采用Platinum®Taq DNA Polymerase-PCR试剂盒检测血清miR-146a水平，实验过程严格按照试剂盒说明书进行，miRNA提取试剂盒货号A33252购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，miRNA反转录试剂盒购自索莱宝生物科技有限公司，Platinum®Taq DNA Polymerase（PCR）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。反应体系20μl，反应条件：95℃ 5s；60℃ 40s；共40个循环。每份样品设3个重复，取平均值。miR-146a及内参U6的引物序列见表１。采用２–△△CT法分析miR-146a的相对表达量。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组基线资料比较

各组患者间年龄、体质量指数、性别、糖尿病病程、吸烟构比比较，差异均无统计学意义（>0.05）。大量尿白蛋白组患者的收缩压高于尿白蛋白正常组，差异有统计学意义（<0.05）。见表2、表3。

2.2 实验室指标、炎症因子及miR-146a的比较

各组患者间空腹血糖、LDL-C、TG、HDL-C、TC、维生素D及HOMR-IR比较，差异均无统计学意义（>0.05）。微量尿白蛋白组和大量尿白蛋白组患者的肌酐、尿酸及TNF-α水平均高于尿白蛋白正常组（<0.05），且呈递增趋势。微量尿白蛋白组较尿白蛋白正常组HbA1c更高（<0.05）。微量尿白蛋白组和大量尿白蛋白组患者的miR-146a水平低于尿白蛋白正常组（<0.05），呈递减趋势，见表3～表5。

表2 各组患者的性别、吸烟、糖尿病病程、年龄及体质量指数比较

表3 各组患者的收缩压、肌酐、尿酸、维生素D及LDL-C比较

注：1mmHg=0.133kPa；与尿白蛋白正常组比较，#<0.05；与微量尿白蛋白组比较，△<0.05

表4 各组患者的HDL-C、TC、TG及HbA1c比较

注：与尿白蛋白正常组比较，*<0.05

表5 各组患者的HOMA-IR、空腹血糖、TNF-α及miR-146a比较

注：与尿白蛋白正常组比较，*<0.05；与尿白蛋白正常组比较，#<0.05与微量尿白蛋白组比较，△<0.05

2.3 UACR、血清miR-146a水平与其他指标的相关性

UACR与糖尿病病程、HbA1c、收缩压、TC、肌酐、尿酸及TNF-α呈正相关（分别为0.182、0.254、0.263、0.202、0.313、0.280、0.824，均<0.05），与miR-146a呈负相关（=–0.570，均<0.05）。miR-146a与收缩压、肌酐、UACR及TNF-α呈负相关（分别为–0.233、–0.254、–0.574、–0.538）。

2.4 UACR的影响因素

以UACR为因变量，以糖尿病病程、收缩压、肌酐、尿酸、总胆固醇、HbA1c、miR-146a、TNF-α为自变量，建立多因素Logsitic回归分析模型，研究各指标与UACR间的关系。多因素Logsitic回归分析结果显示，糖尿病病程、肌酐、miR-146a、TNF-α为UACR的独立相关因素，见表6。

表6 UACR影响因素的多因素Logistic回归分析

2.5 miR-146a对DN的预测价值分析

miR-146a预测发生DN（UACR>30mg/g）的AUC为0.796±0.040，其预测DN的敏感度为77.1%，特异性为79.3%（95%：71.7%～87.4%，<0.05），见图1。

图1 miR-146a对糖尿病患者发生糖尿病肾病（UACR>30mg/g）的预测价值

3 讨论

DN的诊断包括病理诊断和临床诊断，目前多以临床诊断为主，尽管DN早期可表现为尿白蛋白阴性，临床症状不显著，但目前UACR仍是可靠敏感的DN的早期检测指标。因此，可早期通过UACR及时发现DN，预防与延缓其发生、发展，从而改善糖尿病患者的生活质量[8]。miR-146a定位于第5号染色体第2外显子，其可参与炎症反应、胰岛素抵抗、促炎因子等过程。研究发现，miR-146a通过NF-κB的反馈环路在固有免疫和适应性免疫中发挥重要作用[9-10]。在大鼠模型中，miR-146a通过抑制NF-κB信号通路，使其下游IL-1β等炎症因子的释放减少，减少细胞凋亡，从而对肾脏发挥保护作用[11]。另有基础研究表明，miR-146a可通过M2巨噬细胞的极化发挥肾脏保护作用[12]。国外报道显示，miR-146a rs2910164是糖尿病神经病变的易感基因，CC基因型和C等位基因增加了T2DM的患病风险[13]。王国风等[14]研究认为，miR-146a基因多态性增加了糖尿病神经病变的风险。杜菲菲等[15]发现，miR-155及miR-146a水平在糖尿病患者中显著低于健康对照人群。以上临床及基础研究表明，miR-146a可能通过减轻炎症反应降低糖尿病及DN的发生风险。

本研究通过单因素组间分析发现，随着UACR的升高，TNF-α水平上升及miR-146a下降。相关分析发现，UACR与糖尿病病程、收缩压、甘油三酯、肌酐、尿酸及TNF-α呈正相关，与miR-146a呈负相关，同时相关分析发现，miR-146a与收缩压、肌酐、UACR及TNF-α呈负相关。进一步通过多因素Logistic回归性分析后可见，miR-146a对DN的影响独立于血糖、血脂之外，其表达水平与UACR的水平密切相关。结合Bhatt等[7]的动物试验研究推测T2DM患者miR-146a水平下降通过靶向TRAF6基因促进TNF-α等炎症因子的分泌，促进DN的发生、发展。另外，ROC曲线分析结果表明，利用miR-146a预测DN，其敏感度和特异性均较高，可作为诊断DN的标志物。目前DN早期诊断发现是临床面临的重要问题，越早发现DN高危人群并积极地干预可延缓其进一步的发生、发展，避免患者病情的加重及生活质量的受损。miRNA的深入研究可更好地探究糖尿病及其并发症的发病机制，可作为高危人群新的标志物，为糖尿病的诊断、治疗及预防提供新的方向。

综上所述，T2DM患者血清中miR-146a的降低，可能通过TNF-α等炎症因子的升高介导T2DM患者的肾脏损伤，miR-146a可能成为DN早期的血清标志物。但本研究也存在局限性：本研究为观察性研究，需要今后前瞻性、更大样本的研究进一步论证miR-146a对糖尿病及DN的早期发现及病情严重程度的影响。

[1] LUK A O Y, HUI E M T, SIN M C, et al. Declining trends of cardiovascular-renal complications and mortality in type 2diabetes: the Hong Kong diabetes database[J]. Diabetes Care, 2017, 40(7): 928–935.

[2] ALICIC R Z, ROONEY M T, TUTTLE K R, et al. Diabetic kidney disease:challenges, progress, and possibilities[J]. Clin J Am Soc Nephrol, 2017, 12(12): 2032–2045.

[3] HU J, YANG S, ZHANG A, et al. Abdominal obesity is more closely associated with diabetic kidney disease than general obesity[J]. Diabetes Care, 2016, 39(10): 179–180.

[4] OLIVIERI F, PRATTICHIZZO F, GIULIANI A, et al. MiR-21 and miR-146a: the microRNAs of inflammaging and age-related diseases[J]. Ageing Res Rev, 2021, 70: 101374.

[5] MENSA E, GIULIANI A, MATACCHIONE G, et al. Circulating miR-146a in healthy aging and type 2 diabetes:Age- and gender-specific trajectories[J]. Mech Ageing Dev, 2019, 180: 1–10.

[6] 洪盈盈, 赵晓宏, 周庆元. 外周血microRNA-46a的表达与周围神经病变的关系[J]. 国际内分泌代谢杂志, 2018, 38(1): 6–9.

[7] BHATT K, LANTING L L, JIA Y, et al. Anti- inflammatory role of microRNA-146a in the athogenesis of diabetic nephropathy[J]. J Am Soc Nephrol, 2016, 27(8): 2277–2288.

[8] 李启富. 中国糖尿病肾脏疾病防治临床指南[J]. 中华糖尿病杂志, 2019, 11(1): 15–28.

[9] LEE H M, KIM T S, J E K, et al. MiR-146 and miR-125 in the regulation of innate immunity and inflammation[J]. BMB Rep, 2016, 49(6): 311–318.

[10] YANG Y, WANG J K. The functional analysis of microRNAs involved in NF-κB signaling[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2016, 20: 1764–1774.

[11] YU H Y, MENG L F, LU X H, et al. Protective effect of miR-146 against kidney injury in diabetic nephropathy rats through mediating the NF-kB signaling pathway[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2020, 24: 3215–3222.

[12] ZHANG Y Q, XI L,ZHENG S, et al. MicroRNA- 146a-5p-modified human umbilical cord mesenchymal stem cells enhance protection against diabetic nephropathy in rats through facilitating M2 macrophage polarization[J]. Stem Cell Res Ther, 2022, 13(1): 1–16.

[13] ZIONI S S, CHARLES E J W, KOTTEESWARAN R, et al. Association of microRNA-146a rs2910164 polymorphism with type II diabetes mellitus in a South Indian population and a meta-analysis[J]. Gene reports, 2020, 18: 100567．

[14] 王国凤, 尹冬, 徐宁. miR-146a rs2910164多态性对miR-146a 表达的影响及与糖尿病周围神经病变的相关性研究[J]. 中国糖尿病杂志, 2019, 27(2): 102–107.

[15] 杜菲菲, 马越. miR-155、miR-146a在糖尿病肾病患者血清中的表达及诊断价值[J]. 中国医师杂志, 2020, 22(12): 1831–1835.

Correlation between serum miR-146a and diabetic nephropathy in patients with type 2 diabetes mellitus

XU Chenggao, LUO Lijun

1.Department of Endocrinology, the First Hospital of Jiaxing, Jiaxing 314000, Zhejiang, China; 2.Department of Pediatrics, the First Hospital of Jiaxing, Jiaxing 314000, Zhejiang, China

To investigate the relationship between miR-146a, tumor necrosis factor-α (TNF-α) and diabetic nephropathy in patients with type 2 diabetes mellitus.A total of 128 patients with type 2 diabetes mellitus admitted to the Department of Endocrinology, the First Hospital of Jiaxing from December 2020 to January 2022 were collected. According to the urinary albumin-to-creatinine ratio (UACR), the patients were divided into three groups: urinary albumin normal group (UACR<30mg/g, 58 cases); microalbuminuria group (30mg/g≤UACR<300mg/g, 44 cases); macroalbuminuria group (UACR≥300mg/g, 26 cases). The baseline data of all patients were collected, the expression level of serum miR-146a was detected by real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), and the expression level of serum TNF-α was detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The relationship between miR-146a, TNF-α and UACR was analyzed.Compared with the urinary albumin normal group, the level of TNF-α in the microalbuminuria group and macroalbuminuria group were significantly increased, and showed an increasing trend, the differences were statistically significant (<0.05). The level of miR-146a in the microalbuminuria group and macroalbuminuria group were lower than those in urinary albumin normal group, and the differences were statistically significant (<0.05). Spearman correlation analysis showed that miR-146a was negatively correlated with UACR (=–0.574,<0.05), and TNF-α was positively correlated with UACR (=0.824,>0.05). The sensitivity and specificity of miR-146a in predicting diabetic nephropathy were 77.1% and 79.3% (95%: 71.7%-87.4%,<0.05).Serum miR-146a and TNF-α in patients with diabetic mellitus can be used as molecular markers to predict diabetic nephropathy and contribute to the early diagnosis of diabetic nephropathy.

Type 2 diabetic nephropathy; MiR-146a; TNF-α

R587

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.29.010

浙江省嘉兴市科技计划项目（2019AD32172）

罗丽君，电子信箱：m18660927939@163.com

（2023–08–30）

（2023–09–05）