HLA-DRB1基因多态性与早发型重度子痫前期遗传易感性的研究

赖春池 张璐璐 孙梦雅 孙俊芳 姜红

（青岛大学附属医院新生儿科，山东青岛 266000）

子痫前期（preeclampsia, PE）是一种常见的妊娠并发症，重度子痫前期（severe preeclampsia,sPE）病情呈持续性进展，常导致胎儿早产和母亲心血管疾病风险增加，严重者可伴有多器官功能衰竭，威胁母婴生命［1-2］。大量研究表明，早发型PE 产妇围生期不良预后、新生儿严重并发症的发生率和病死率均高于晚发型［3-4］。

人类白细胞抗原（human leucocyte antigen,HLA） 是主要组织相容性复合物（major histocompatibility complex, MHC） 的表达产物，HLA-DR 抗原是HLA基因系统中的重要抗原之一，决定其特异性的主要编码基因DRB1座位具有高度多态性。既往研究表明，HLA-DRB1rs3135388 位点的多态性是多发性硬化症的易感因素［5］；另有研究显示，rs3135388及rs2308765位点与高血压疾病可能存在一定相关性［6］。本研究通过对母婴HLA-DRB1基因rs3135388与rs2308765位点所在片段进行测序，筛选单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP） 位点，探究HLADRB1基因多态性与产妇早发型sPE 遗传易感性的关系。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究共纳入2016年12月—2017年12月期间在青岛大学附属医院分娩的产妇及其新生儿222对，所有研究对象临床资料完整。选取早发型sPE产妇及其新生儿102对为sPE组，同期血压正常产妇及其新生儿120对为对照组。对照组产妇平均年龄为（31±4）岁，新生儿平均胎龄为（39.0±2.5）周。sPE 组产妇平均年龄为（33±5）岁，新生儿平均胎龄为（32.5±2.6）周。早发型sPE的诊断标准参照有关国际实践管理建议［7］。排除标准：（1）产妇既往有原发性高血压、肾功能不全、肝功能损伤、糖尿病和自身免疫性疾病等病史；（2）染色体异常；（3）胎儿为多胎、死胎及严重胎儿畸形等。本研究已获青岛大学附属医院伦理委员会批准（审批号：QYFY WZLL 27688），研究对象均已签署相关知情同意书。

1.2 方法

抽取产妇清晨空腹外周肘静脉血2 mL 置于EDTA 管中，胎儿娩出后抽取脐带血2 mL 置于EDTA 管中。标本保存在-80°C 冰箱中备用。使用北京天根生化有限公司全血基因组DNA 提取试剂盒（离心柱型）提取DNA。取2 μL 样品用微量紫外分光光度仪（美国Thermo 公司）对DNA 进行纯度与浓度测定。HLA-DRB1基因rs3135388 和rs2308765 位点引物序列见表1，引物由美国Applied Biosystems 生物公司合成。1 μL DNA、1 μL 引物溶液（上游引物0.5 μL 和下游引物0.5 μL）、10 μL去离子水和7 μL 2×PCR Mix混匀，放入C1000TM Thermal Cycler（Bio-Rad, USA）荧光定量PCR 仪中，反应条件为：95°C 5 min，94°C 45 s，57°C 1 min，30个循环。

表1 HLA-DRB1基因相关片段的引物序列

采用Sanger测序法获得基因分型，测序结果由BioEdit Sequence Alignment Editor 直接得出，统计每个研究对象在各个位点的基因型分布。同一位点3种基因型图像如图1～3所示。

图1 rs114293611 位点的Sanger 测序结果 箭头处表明该位点一代测序结果读取为CC。

图2 rs114293611 位点的Sanger 测序结果 箭头处表明该位点一代测序结果读取为CT。

图3 rs114293611 位点的Sanger 测序结果 箭头处表明该位点一代测序结果读取为TT。

1.3 统计学分析

使用SPSS 25.0 对数据进行统计学分析。计量资料以均值±标准差（±s）表示，两组间比较采用成组t检验。计数资料以例数和百分率（%）表示，组间比较采用卡方检验或Fisher 确切概率法。对对照组基因型进行Hardy-Weinberg 平衡检验，P＞0.05 说明该数据具有群体代表性，遵循遗传规律。采用多因素logistic 回归模型分析等位基因频率与sPE发生的关系。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组临床资料的比较

sPE组产妇年龄、生产次数、收缩压和舒张压均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；sPE组新生儿胎龄、出生体重、1 min 及5 min Apgar 评分均低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组相比，sPE组新生儿宫内窘迫和窒息的发生率显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。两组产妇的怀孕次数及新生儿性别的比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 两组临床资料的比较

2.2 HLA-DRB1基因SNP位点

在 2 个基因片段中发现 rs3135388、rs114293611 和rs142804168 3 个SNP 位点，已知的rs2308765 在本研究所选研究对象中未体现出多态性。上述3个SNP对照组基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡检验（P＞0.05）。

2.3 两组HLA-DRB1 基因rs114293611 位点基因型分布和等位基因频率比较

sPE组产妇rs114293611位点的CC、CT、TT基因型分布与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），而两组产妇在该位点的等位基因频率的比较差异无统计学意义（P＞0.05）。在新生儿中，rs114293611 位点的基因型分布和等位基因频率分布在两组之间差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3～4。

表3 两组rs114293611位点基因型比较 ［n（%）］

表4 两组rs114293611位点等位基因频率比较 ［n（%）］

2.4 两组HLA-DRB1 rs3135388 和rs142804168位点基因型分布和等位基因频率比较

rs3135388和rs142804168位点的基因型分布和等位基因频率在两组产妇及新生儿之间差异均无统计学意义（P＞0.05），见表5～6。

表5 两组rs3131388和rs142804168位点基因型比较［n（%）］

表6 两组rs3131388和rs142804168位点等位基因频率比较 ［n（%）］

2.5 rs114293611位点基因型母婴配伍分析

选择产妇与新生儿差异均有统计学意义的rs114293611 位点进行母婴配伍，结果显示sPE 组和对照组在基因型相容性上差异具有统计学意义（P＜0.05），见表7。

表7 两组母婴携带的rs114293611位点基因型的相容性比较 ［n（%）］

3 讨论

PE的发病机制尚未完全阐明。目前公认的PE两阶段模型指出，第一阶段胎盘灌注不足或异常胎盘触发临床表现出现，第二阶段母亲个体因素（环境、遗传或行为）与之相互作用而加剧导致孕产妇综合征［8-9］。研究表明，胎儿携带的HLA基因一半来自母亲，一半来自父亲［10］。在妊娠过程中，HLA 的产物在正常的胎儿滋养层细胞上表达，与母体子宫自然杀伤细胞上表达的杀伤IgG样受体相互作用，维持母胎之间免疫平衡［11］。

在正常妊娠中，绒毛细胞滋养层和合胞体滋养层不表达HLAⅠ类和Ⅱ类分子，侵袭性绒毛外滋养层仅表达Ⅰ类分子（HLA-C、HLA-G、HLA-E和HLA-F）［12-13］。这一机制对于母胎免疫耐受平衡至关重要，其有效阻止了母体T 细胞针对父源性MHC 抗原的同种免疫反应，使妊娠顺利继续。一旦这种免疫平衡被打破，就可能出现母胎间免疫耐受失衡，抑制自然杀伤细胞产生参与血管生成和血管稳定的细胞因子，影响外滋养层浸润和母体胎盘床血管重塑，从而导致滋养细胞浸润不足、胎盘螺旋动脉生理转化异常，引起胎盘功能失调、胎盘灌注障碍继而发展为PE［11，14］。HLA-DR 属HLAⅡ类，表达于专业抗原递呈细胞上，向T细胞呈递外源性抗原，引起特异性免疫应答。研究发现，PE 孕妇的胎盘和合体滋养层细胞来源的细胞外囊泡中HLA-DR分子异常表达，而正常妊娠的孕妇未检测到HLA-DR分子表达［15-16］，这一发现为探索PE发病机制提供了新思路。

目前针对HLA基因多态性与PE的关系已有大量研究报道。研究显示，PE组孕产妇HLA-DRB1*06和HLA-DRB1*07基因频率显著高于对照组，提示其可能是PE 发生的易感因素［17］。HLA-G基因29799440 位点的SNP 与产妇PE 的易感性存在联系［18］。Mohammadi 等［19］研究发现，HLA-DQB1基因多态性与PE的发生有关，HLA-DQB1*0602位点的缺乏可能是PE的危险因素。另外，有研究发现，配偶间HLAⅡ类基因相容性与sPE的发生有关［20］。Zheng 等［21］发现母胎间HLA-A基因相容有利于母胎对妊娠的免疫耐受。

本研究根据HLA-DRB1基因rs3135388 位点与多发性硬化症的发生相关文献查询结果，获得其上下游引物片段［6］。本研究通过基因测序发现了新的SNP 位点rs114293611 和rs142804168。在102对sPE 组母婴和120 对对照组母婴之间进行Sanger测序基因分型分析中，结果显示，rs114293611 位点基因型分布在sPE组和对照组产妇之间的差异有统计学意义；同时，在两组新生儿间的比较中，rs114293611 位点的基因型分布差异也具有统计学意义。这表明HLA-DRB1基因rs114293611 位点的SNP 可能与早发型sPE 发生有关。此外，在sPE 组新生儿中，rs114293611 位点的T 等位基因频率高于对照组，提示携带T等位基因的新生儿其母亲患早发型sPE 的概率是携带C 等位基因的1.919 倍（OR=1.919，P＜0.05），表明HLA-DRB1rs114293611位点T等位基因可能是sPE的危险基因。其发病机制可能是该位点等位基因由C变为T时，相应氨基酸表达由色氨酸变为亮氨酸，从而影响蛋白功能表达，并进一步导致sPE的发生，但具体机制尚不清楚，有待进一步研究。然而，对于rs3135388 和rs142804168 位点而言，两组母婴之间的基因型分布和等位基因频率差异均无统计学意义，尚不能认为这两个位点的SNP与sPE的发生相关。为进一步探讨HLA-DRB1基因在sPE组和对照组的母婴传递上是否存在差异，我们将母婴按rs114293611 位点的基因型分布进行配伍统计，结果显示sPE组和对照组在基因型相容性上存在显著差异，表明rs114293611位点在母婴双方基因型多态性不相容，可能与胎儿来源于父系基因导致母胎之间免疫紊乱有关，从而参与sPE的发病过程，然而具体发病机制还需要进一步研究。

综上所述，HLA-DRB1基因rs114293611 位点SNP 可能与产妇早发型sPE 的发生相关。HLADRB1基因rs114293611 位点母婴基因型配伍异常可能是产妇患早发型sPE的易感因素。然而，本研究的研究对象局限于中国北方女性，样本量小。此外，sPE是一种复杂的多基因遗传病，本研究仅选取了1个基因的3个SNP 位点，对于不同位点间是否存在相互作用未进行研究。今后还需进行扩大范围及样本量、涉及不同基因和多个位点的研究，进一步加深对sPE发病机制的认知，以便更好地指导临床诊断和治疗。

利益冲突声明：所有作者声明不存在任何利益冲突。