光核桃AmSO基因初克隆及生物信息学分析

鲍 馨,李建欣,孟凡娟

(东北林业大学 生命科学学院,哈尔滨 150040)

光核桃(Amygdalusmira)是蔷薇科桃属植物,是极其罕见的“活化石群”,同时也是中国二级保护植物。它属于落叶乔木,树干庞大,寿命可达数千年,这是世界上较为稀有的桃种质资源[1]。光核桃通常生长在海拔2600m～4200m,主要分布在雅鲁藏布江下游、尼洋河和帕隆藏布江流域[2]。光核桃生长速度快、自然更新能力强、适应能力极强。光核桃具有抗旱性[3]、抗寒性[4]、遗传多样性高的特点,是筛选抗旱、抗寒等性状的优良桃树资源。目前,对光核桃的研究多集中在其生理特征[3,5]、生物遗传多样性[6-8]及加工利用[9-11]等方面。

1 材料与方法

1.1 试验材料

光核桃种子由东北林业大学生命科学学院遗传学实验室提供,种子于2021年1月4 ℃春化处理,同年3月在黑龙江省哈尔滨市东北林业大学温室(25 ℃左右)内播种,萌发后移栽至直径 21 cm、深25 cm并且盆底有排水孔的花盆中,土壤体积比例为花神土∶蛭石=3∶1,选取3月龄光核桃顶端幼嫩叶片,液氮速冻,于-80 ℃冰箱保存,备用;大肠杆菌感受态(DH5α)由东北林业大学生命科学学院遗传学实验室提供。

1.2 试验试剂

Gel Extraction Kit(康为世纪生物科技有限公司)、Plant RNA simple Total RNA Kit(康为世纪生物科技有限公司)、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)、2×Phanta Max Master Mix(Vazyme)、rTaq(TaKaRa)、dNTP Mix(TaKaRa)、10×LA PCR Buffer Ⅱ(TaKaRa)、氨苄青霉素(Amp)、琼脂粉、胰蛋白胨、1 mmol/L NaOH、NaCl、酵母提取物等。

1.3 光核桃AmSO基因初克隆

1.3.1 光核桃AmSO基因引物设计与合成 光核桃与碧桃(Prunuspersica)同属于桃属,亲缘关系较近,因此推断二者SO基因序列相似度较高。根据GenBank中碧桃PpSO基因序列信息,运用Premier 5.0软件进行引物设计,引物序列如下:AmSO-F:ATGCCTGGCGTCAGAGGG;AmSO-R:CTACAAATTCGAGTGACCAACT CGAAC,引物由吉林省库美生物科技有限公司进行合成。

1.3.2 光核桃总RNA的提取及cDNA的合成 取幼嫩叶片0.1 g,于液氮中充分研磨,按照Plant RNA simple Total RNA Kit操作说明书,提取光核桃叶片总RNA,加入适量DEPC水充分溶解,10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量,NanoDrop分光光度计测定RNA样品浓度。利用反转录试剂盒PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA主要步骤如下:取2 μL 4×DN Master Mix和1 μg变性的总RNA于200 μL PCR管中,加入Nuclease-free water补齐至8 μL,充分混匀离心,37 ℃温育5 min,所得 8 μL DNA消化液中加入2 μL 5×RT mmⅡ, 37 ℃孵育15 min后;立即50 ℃水浴5 min, 98 ℃水浴5 min使酶失活,反应后的产物即为cDNA的第一链。

1.3.3 光核桃AmSO基因cDNA克隆 以光核桃cDNA为模板,通过PCR扩增包含光核桃AmSO基因全部编码区的cDNA序列。PCR扩增体系为2 μL cDNA、1.5 μL AmSO-F、1.5 μL AmSO-R、15 μL 2×Phanta Max Master Mix、10 μL ddH2O共30 μL,PCR扩增程序: 95 ℃预变性3 min;95 ℃变性15 s,58 ℃退火 15 s,72 ℃延伸90 s,共35 个循环;72 ℃再延伸5 min;温度降至10 ℃保存。用15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测,目的片段大小一致且单一的条带,利用Gel Extraction Kit试剂盒回收PCR扩增产物。胶回收产物加PolyA尾,反应体系为:7 μL胶回收产物、2 μL 10×LA PCR Buffer Ⅱ、0.8 μL dNTP Mix、0.2 μL rTaq共10 μL,72 ℃水浴30 min,反应结束后取出置于冰上,将4 μL连接PolyA尾的目的基因片段、1 μL pMD18-T载体及 5 μL Solution Ⅰ混合溶液4 ℃过夜;将连接产物转化至大肠杆菌感受态(DH5α)中。主要操作步骤参照唯地生物大肠杆菌感受态(DH5α)说明书,次日挑取单菌落进行PCR阳性克隆检测,最后挑选无杂带、目的基因片段大小正确的阳性克隆菌落送样测序,测序由睿博兴科生物技术有限公司哈尔滨分公司完成,完成后进行序列比对。

1.4 光核桃AmSO基因生物信息学分析

1.4.1 AmSO蛋白质理化性质分析 利用在线分析网站ExPASy(https://www.expasy.org/)中ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)对光核桃AmSO蛋白的相对分子质量、等电点、氨基酸组成以及不稳定系数等多种理化性质参数进行分析,并利用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)在线分析软件,通过Hphob./Kyte &Doolittle算法对光核桃AmSO蛋白的亲疏水性进行分析。利用在线分析软件EMBL-EBI中的Search Pfam工具(http://pfam.xfam.org/search/sequence)对光核桃AmSO蛋白结构域进行预测。

1.4.2 氨基酸序列分析与系统进化树构建 通过DANMAN 8.0软件将光核桃AmSO基因的核苷酸序列翻译为氨基酸序列,再利用NCBI中BLAST对该基因的编码氨基酸序列进行同源性比对,并选择DANMAN 8.0中Sequence-Aligment-Multiple aligment sequence进行多序列氨基酸比对分析;同时使用MEGA 5.0软件构建系统进化树,选择Construct/Test Neighbor-Joining Tree,Bootstrap Replications自检举 1 000次。

1.4.3 AmSO蛋白质二级结构和三级结构预测 运用GOR4(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.htmL)在线分析网站对光核桃AmSO蛋白的二级结构进行预测;使用Swiss-Model(https://swissmodel.expasy.org/)在线分析软件,运用同源建模法(Homolog Modeling)对光核桃AmSO蛋白的三级结构进行预测以及建立三级结构模型。

1.4.4 AmSO蛋白质信号肽和跨膜区预测 运用SignalP-4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/)在线分析网站对光核桃AmSO蛋白的信号肽进行预测,主要使用嵌套交叉验证方法完成。利用ExPASy中的TMpred(http://sbcb.bioch.ox.ac.uk/TM_noj/TM_noj.htmL)在线分析软件预测光核桃AmSO蛋白的跨膜区域。

2 结果与分析

2.1 光核桃AmSO基因初克隆

运用Premier 5.0软件设计引物,以光核桃cDNA为模板对光核桃AmSO基因进行PCR扩增,用15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测,获得一条长度1 182 bp的明亮的特异性条带(图1),与预期大小相符。

图1 AmSO基因的克隆Fig.1 Cloning of AmSO gene

2.2 生物信息学分析

2.2.1 AmSO蛋白质理化性质分析 由表1可以看出,AmSO蛋白由1 940 个C、3 036 个H、540 个H、571 个O、12 个S原子组成,其分子式为C1940H3036N540O571S12,共有393个氨基酸,相对分子质量为43.45 ku,该蛋白的等电点为8.44,脂肪族氨基酸指数为82.54,AmSO蛋白的平均亲水性和不稳定系数分别为-0.327和36.69,表明AmSO是一种稳定的亲水性蛋白。

表1 AmSO蛋白理化性质分析Table 1 Analysis of AmSO protein on physical and chemical properties

通过ExPASy-ProtScale对AmSO蛋白进行亲疏水性结构域预测(图2),结果进一步表明AmSO蛋白为亲水性蛋白,并具有29个亲水结构域和30个疏水结构域。

图2 AmSO蛋白亲水性和疏水性预测Fig.2 Prediction of hydrophilicity and hydrophobicity of AmSO protein

利用在线分析软件EMBL-EBI中的Search Pfam工具对光核桃AmSO蛋白结构域进行预测(图3),在AmSO氨基酸序列N端(第53～236位氨基酸)含有Oxidored molyb(氧化钼)结构域,该活性位点属于Ubiquitin superfamily (CL0072),存在于各种氧化还原酶中,此结构域与钼辅因子结合;C端(第258～389位氨基酸)含有Mo-co dimer(钼钴二聚体)结构域,该活性位点属于E-set (CL0159),常存在于钼钴氧化物还原酶中,它参与二聚体的形成,具有Ig-折叠结构。SO作为钼酶家族成员之一,对其蛋白质的结构域进行预测,可以为探究该蛋白功能提供理论基础。

图3 AmSO蛋白结构域预测Fig.3 Prediction of AmSO protein domain

2.2.2 氨基酸序列分析与系统进化树构建 运用MEGA 5.0软件构建光核桃AmSO基因编码氨基酸序列的系统进化树(图4),便于了解多物种之间的进化关系。选取9个与光核桃AmSO氨基酸序列同源性较高的物种构建进化树,其中碧桃PpSO与光核桃AmSO亲缘性最近,拟南芥中AtSO同源基因共有3 个,分别命名为AtSO1、AtSO2、AtSO3,根据进化树分析可知拟南芥AtSO与光核桃AmSO亲缘关系最远。

图4 AmSO蛋白的系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of AmSO protein

利用BLAST程序进行氨基酸序列同源性的比对分析(图5),碧桃、扁桃、苹果、秋子梨、拟南芥、毛果杨等8个物种与光核桃同源性较高。碧桃PpSO与光核桃AmSO的一致性最高为100%;拟南芥AtSO3与光核桃AmSO的一致性最低为48.09%。结果表明SO蛋白结构域在多物种之间表现出高度的一致性,进化保守性高。

Am. 光核桃 Pp. 碧桃;Pt. 毛果杨;Pd. 扁桃;Md. 苹果;Mn. 川桑;Pyr. 秋子梨;At. 拟南芥;Rch. 月季。红色直线(第53～236位氨基酸)部分表示Oxidored molyb;绿色直线(第258～389位氨基酸)部分表示Mo-co dimer

2.2.3 AmSO蛋白质二级结构和三级结构预测 通过GOR4对光核桃AmSO蛋白的二级结构分析(图6),该蛋白由19.34%的α-螺旋、 26.46%的扩展链和54.20%的无规则卷曲组成。

AmSO蛋白共由393个氨基酸组成,其中α-螺旋(Hh)有76个位点、扩展链(Ee)有104个位点、无规则卷曲(Cc)有213个位点。因此,AmSO蛋白二级结构主要由无规则卷曲组成。

运用SWISS-MODEL在线分析软件对光核桃AmSO蛋白的三级结构进行预测,预测出的三级结构模型以PDB序列号为1ogp.1.A,其寡聚状态显示为Homo-dimer,与目标序列的一致度为82.70%,符合要求,光核桃AmSO蛋白的三级结构预测结果见图7。此外,QMEAN值为 -0.88,目标序列与模板序列的匹配度较好,说明该模型可用于光核桃AmSO蛋白三级结构的分析模型。

2.2.4 AmSO蛋白质信号肽和跨膜区预测 利用SignalP-4.0在线软件对光核桃AmSO蛋白的信号肽进行预测。结果如图8-A所示,原始剪切位点C-score分析AmSO蛋白在22号位置处得分最高为0.109;综合剪切位点Y-score分析AmSO蛋白在3位置处得分最高为0.113;信号肽S-score分析AmSO蛋白在22号位置处得分最高为0.121;信号肽得分的均值S和最大综合剪切位点加权均值D分别是0.120和0.117,该蛋白S和D的值为0.117,均小于标准参数 0.450,结果表明光核桃AmSO无信号肽,推测其属于胞内蛋白。

图8 AmSO蛋白的信号肽(A)和跨膜区预测(B)Fig.8 Prediction of AmSO protein signal peptide(A) and transmembrane region(B)

蛋白质中的跨膜区通常与细胞功能解密相关,通过光核桃AmSO蛋白跨膜区结构预测,结果如图8-B所示,该蛋白具有双向跨膜能力,不仅具有1个由内向外的不显著跨膜结构域,位置为115～134 Aa,预测分数为359(分数大于500为显著跨膜结构域);而且存在由外向内不明显的跨膜结构域1个,位置为114～130 Aa,预测分数为116。以上结果表明光核桃AmSO蛋白可能作为膜受体或者离子通道蛋白,在细胞中发挥作用。

3 结论与讨论

本研究通过分子克隆技术获得光核桃AmSO基因完整的CDS区域,结果表明光核桃AmSO基因编码序列全长1 182 bp,编码393个氨基酸,蛋白质相对分子质量为43.45 ku。生物信息学预测和分析表明,AmSO蛋白是一种能在细胞内发挥生物学作用的稳定碱性亲水蛋白,预测属于双向跨膜结构域,具备一个由内向外的不显著跨膜结构域和一个由外向内的不显著跨膜结构域,该蛋白没有信号肽。蛋白质的二级结构由无规则卷曲、α-螺旋和延伸链构成,所占比例分别为54.20%、19.34%、26.46%;AmSO蛋白在N端含有与钼辅因子结合的氧化钼结构域,存在于氧化还原酶中;C端含有钼钴二聚体结构域,参与二聚体结合。系统进化树分析表明光核桃AmSO与碧桃PpSO亲缘性最近;在对光核桃AmSO氨基酸序列与其他植物比对后发现,在进化过程中该蛋白结构域具有较高的保守性,可用于和特定的区域相互作用,以此控制基因的转录。

目前植物中SO基因的功能主要是利用模式生物拟南芥进行研究,发现调节硫代谢从而正调控植物耐旱性,但有研究发现该基因能够增强植株的抗病性,这也为后续研究SO功能提供理论依据和研究新思路。尽管许多SO提高植物的抗逆功能相继被报道,但光核桃中AmSO基因氧化解毒机制与光核桃抗逆性之间的分子机制尚未研究。因此,通过对光核桃AmSO基因进行生物信息学分析,随着对SO结构和功能深入研究,可以为进一步探究SO在分子水平如何发挥作用提供理论依据,为探究其胁迫响应机制奠定初步基础。