活血清热解毒方通过JAK/STAT 信号传导通路调控动脉粥样硬化的分子机制探讨*

Nguyen Xuan Huynh（阮春黄） 梁 硕 孟 毅 刘志勇△

（1.河南中医药大学，河南郑州 450003；2.河南中医药大学第二临床医学院，河南中医药大学第二附属医院，河南郑州 450002；3.河南省中医院，河南郑州 450002）

动脉粥样硬化（AS）是一种血管慢性炎症性疾病，以大动脉、中动脉内膜下脂质沉积、纤维组织增生、粥样斑块形成、血管壁硬化为主要特征［1］。AS 形成和发展过程中导致的管腔狭窄、斑块破裂、血栓形成等是导致冠心病等心血管疾病发生的重要病理基础［2］。近年来，如何有效控制AS 发生、降低终点事件的发生率是临床研究的焦点。以降脂药为主体的治疗方案仍旧是现阶段AS 的主要治疗方案，虽然有一定的效果，但是存在副作用明显，且患者梗死后仍有复发的风险［3］。关于AS的发生机理目前尚无明确定论，近年来炎性学说逐渐成为研究的重点，免疫炎症成为抗AS新的突破口。伴随着中医药在临床上的广泛使用，其在心血管疾病中的良好的治疗效果也逐渐获得认可。中医药在调节免疫炎症反应防治AS领域也取得重要进展，诸多研究均证实活血、清热、益气等中药单体或复方在缩小AS 斑块面积、减轻AS 程度方面疗效卓著［4-5］。本院自拟活血清热解毒方契合“因瘀化毒、因毒致变”的理论，在AS患者中取得良好的效果，但是关于其具体作用机制仍有待深入探索。酪氨酸蛋白激酶/信号转导和转录激活因子（JAK/STAT）信号通路是炎症因子转导的关键途径，参与细胞生长、迁移、死亡，调控免疫反应，在AS的发生和发展过程中发挥重要作用［6-7］。本次研究通过分析活血清热解毒方对AS大鼠JAK/STAT 信号传导通路调控作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级Wistar 大鼠48 只，雄性，8 周龄，体质量180～220 g，购于赛业（固安）生物科技有限公司，许可证号SCXK（冀）2021-003。适应性饲养1 周后用于后续研究。分笼饲养，每笼5 只，12 h 光暗同步，室温（24±2）℃，相对湿度（55±5）%。本次研究经河南中医药大学动物伦理会审批通过，伦理批号：A202208407。

1.2 实验药物

活血清热解毒方：太子参20 g，制首乌10 g，水蛭3 g，天麻6 g，胆南星3 g，全蝎3 g，决明子12 g，蜈蚣3 g，桃仁6 g，红花6 g。由医院中药房提供，清水煎熬，药液浓缩为含生药1.20 g/mL。维生素D3注射液（上海通用药业股份有限公司，国药准字H31021404）；阿托伐他汀钙（天方药业有限公司，国药准字H20093757）。

1.3 试剂与仪器

TC/TAG（上海羽朵生物科技有限公司，货号：TC1239、TC1250）；HDL/LDL 试剂盒（长春汇力生物技术有限公司，K026a、K026b）；白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-10（IL-10）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、MCP-1 ELISA 试剂盒（Clin-MaxTM公司，货号：IL6-H4218、ILB-H4110、IL0-H5219、TNA-H8211、CC2-H5255）；AK2、STAT3、SOCS3 一抗（Thermo Fisher 公司，货号：MA516565、PA586075、PA587485）。RT 200C 全自动生化分析仪（美国Rayto 公司）；Elx800 全自动酶标仪（美国BioTeK公司）。

1.4 模型制备

48 只大鼠随机分成空白对照组（n=8）和模型组（n=40），空白对照组给予普通饲料喂养，模型组通过高脂饮食饲养联合腹腔注射维生素D3（VD3）的方法建立AS 大鼠模型［8］，大鼠在高脂喂养的同时按照700 000 U/kg总剂量注射VD3溶液，分3 d注射。造模时间为3 周，过程中随机监测精神和饮食状况，造模完成后随机处死6 只大鼠，取主动脉组织进行病理检测，以主动脉有动脉粥样斑块形成为造模成功。造模过程中有2只大鼠死亡，死亡原因为进食过少。

1.5 给药方法

造模组剩余32 只大鼠随机分为模型组、阳性对照组、中药低剂量组、中药高剂量组。除空白对照组正常饮食喂养外，其余各组均继续给予高脂饮食。阳性对照组给予阿托伐他汀钙2.6 mg/（kg·d）灌胃，中药低剂量组给予活血清热解毒方1.2 g/（kg·d）灌胃（相当于成人用药量），中药高剂量组给予活血清热解毒方4.8 g/（kg·d）灌胃（相当于成人4 倍用药量），空白对照组和模型组给予等量生理盐水灌胃，灌胃体积按10 mL/kg小鼠体质量计算，干预时间为12周。

1.6 标本采集与检测

1.6.1 主动脉病理学检测 末次给药后腹腔注射戊巴比妥钠处死，左心室注生理盐水去除积血后，取下心脏和血管，液氮保存并移送至-80 ℃冰箱保存；4%多聚甲醛固定血管，分离主动脉和心脏，常规方法脱水、透明、浸蜡、包埋后制作病理切片。常规行HE 染色，光镜下观察主动脉病理情况。

1.6.2 血清生化指标检测 腹主动脉采血，1 500 r/min离心分离10 min，采用全自动生化分析仪检测总胆固醇（TC）、甘油三酯（TAG）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL），ELISA 法检测血清IL-6、IL-1β、IL-10、TNF-α、MCP-1。

1.6.3 Western blotting检测酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）、信号转导和转录激活因子3（STAT3）、细胞因子信号传导抑制因子3（SOCS3）蛋白表达 主动脉组织标本，裂解、离心后取上清，BCA 试剂盒测定总蛋白浓度，经上样、电泳、转膜、洗膜、一抗、二抗、显影。使用ImageJ软件对目的蛋白条带和内参蛋白进行半定量分析，以β-actin抗体为内参计算蛋白相对表达量。

1.7 统计学处理

应用SPSS24.0 统计软件。计量资料符合正态分布以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 病理学检查结果

HE 染色结果显示，空白对照组大鼠主动脉具有完整的血管弹力纤维层结构，中膜平滑肌细胞规则排列，内膜边缘齐整，未见脂质沉积；模型组大鼠主动脉内膜出可见粥样斑块，部分可见破裂，中膜平滑肌细胞排列不规则，弹力纤维层断裂，可见钙化组织、纤维帽，斑块内有大量中央坏死物质；阳性对照组、中药低剂量组、中药高剂量组相较于模型组病理改变得到有效改善，其中阳性对照组和中药高剂量组改善更为显著。见图1。

图1 各组大鼠主动脉病理观察（HE染色，400倍）

2.2 各组大鼠血脂指标的比较

见表1。与空白对照组比较，模型组大鼠血清TC、TAG、LDL水平显著提高，HDL水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组、中药低剂量组、中药高剂量组大鼠血清TC、TAG、LDL 水平显著降低，HDL 水平显著升高（P＜0.05）；与阳性对照组比较，中药高剂量组大鼠血清TAG、LDL水平明显降低，HDL水平显著升高（P＜0.05）。

表1 各组大鼠血脂指标的比较（mmol/L，±s）

表1 各组大鼠血脂指标的比较（mmol/L，±s）

注：与空白对照组比较，*P ＜0.05；与模型组比较，#P ＜0.05；与阳性对照组比较，△P ＜0.05。下同。

组 别空白对照组模型组阳性对照组中药低剂量组中药高剂量组n8 8 8 8 8 TC 9.85±0.23 15.68±2.35*10.38±1.89#13.75±2.16#11.35±2.05#TAG 0.61±0.08 1.82±0.21*1.26±0.18#1.13±0.15#0.94±0.13#△HDL 3.95±0.38 1.56±0.24*2.93±0.27#2.82±0.20#3.19±0.17#△LDL 3.40±0.41 5.83±0.56*4.49±0.51#4.28±0.45#3.85±0.36#△

2.3 各组大鼠血清炎症因子水平的比较

见表2。与空白对照组比较，模型组大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1 显著升高，IL-10 显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组、中药低剂量组、中药高剂量组大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α、MCP-1 水平显著降低，IL-10水平显著升高（P＜0.05）；与阳性对照组比较，中药高剂量组大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α显著降低（P＜0.05）。

表2 各组大鼠血清炎症因子水平比较（±s）

组别空白对照组模型组阳性对照组中药低剂量组中药高剂量组n8 8 8 8 8 IL-6（ng/L）0.78±0.09 4.56±0.35*2.29±0.23#2.17±0.34#1.97±0.19#△IL-1β（pg/mL）5.13±0.86 12.75±2.28*8.29±1.16#9.38±1.52#6.75±0.95#△IL-10（ng/mL）35.24±3.30 12.38±1.12*24.85±3.23#22.50±2.74#25.83±2.56#TNF-α（μg/L）15.63±1.85 45.52±4.35*32.30±4.10#34.35±3.56#28.35±3.58#△MCP-1（ng/mL）18.64±2.21 43.56±2.98*24.35±3.05#28.67±2.75#25.38±2.85#

2.4 各组大鼠JAK2/STAT3通路相关蛋白表达的比较

见表3、图2。与空白对照组比较，模型组大鼠主动脉JAK2、STAT3、SOCS3蛋白相对表达水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组、中药低剂量组、中药高剂量组大鼠主动脉JAK2、STAT3、SOCS3蛋白相对表达水平显著降低（P＜0.05）；与阳性对照组比较，中药高剂量组大鼠主动脉JAK2、STAT3、SOCS3蛋白相对表达水平显著降低（P＜0.05）。

表3 各组大鼠主动脉JAK2/STAT3通路相关蛋白表达比较（±s）

组 别空白对照组模型组阳性对照组中药低剂量组中药高剂量组n8 8 8 8 8 JAK2 0.32±0.05 0.74±0.13*0.62±0.14#0.58±0.15#0.50±0.08#△STAT3 0.35±0.08 0.86±0.17*0.65±0.15#0.64±0.18#0.57±0.10#△SOCS3 0.29±0.04 0.85±0.20*0.71±0.12#0.68±0.15#0.52±0.08#△

图2 各组大鼠主动脉JAK2、STAT3、SOCS3蛋白条带

3 讨 论

AS 可归于“胸痹心痛”“眩晕”“脉痹”等疾病范畴［9］。中医学认为“瘀血”“痰浊”“热毒”与AS 的发生密切相关，其发病机制大致可概括为情志、饮食、年老、先天不足、外邪侵袭导致的阴阳失衡、脏腑功能失调，而致痰、瘀、毒作用于脉道而发病［10-11］。近年来，现代医家对AS 和易损斑块的中医病机的探讨愈发地深入，概括起来主要有脾虚与痰浊、瘀血说，肝肾亏虚、痰瘀阻络说，痰湿瘀说，毒邪致病说等［12］。结合现代医学，笔者认为“毒”“瘀”是AS 发生的重要病机，AS 发病过程中炎症细胞浸润、炎症介质水平提高等与中医学“毒”“瘀”理论具有高度的相似性［13］。徐浩［14］提出“活血解毒-抑制炎症反应-稳定斑块”的假说，认为活血解毒在AS 易损斑块干预中作用显著。

本次研究从“毒”“瘀”理论出发，采用自拟活血清热解毒方对AS 大鼠模型进行干预，结果显示动脉粥样硬化斑块和血脂浓度明显改善，证实活血清热解毒方降低AS 大鼠模型血清脂质水平，阻断病理进程方面确有效果。方中太子参有益气健脾、生津润肺之功效；制首乌补肝肾、益精血；水蛭破血通经、逐瘀消癥；天麻息风止痉、祛风通络；胆南星清热化痰、息风定惊；全蝎、蜈蚣息风镇痉、通络止痛、攻毒散结；决明子清肝明目、润肠通便；桃仁、红花活血通经、散瘀止痛。全方共奏益气活血、逐瘀消癥、清热解毒之功，通过调节血脂代谢保护血管内皮细胞，增加斑块稳定性。

AS 进程中诸多炎症因子发挥重要作用，IL-1β 为靶点的单抗治疗被证实能够降低冠心病患者心血管事件的发生率［15］。IL-6 广泛存在于机体各个部位，其形成受到白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-4（IL-4）等诸多因素的调控，其余相关受体结合介导细胞中的信号传递，激活AK2/STAT3 信号通路，加强血管平滑肌细胞的增殖能力，加速AS 的发展［16］。MCP-1 是由巨噬细胞与单核细胞分泌，又被称为前炎性因子，能够使多种炎性细胞向病变部位聚集，尤其是单核细胞的聚集效应更为明显，对各种炎症因子的刺激做出应答。MCP-1 还能活化白细胞并介导其产生其他炎症因子，诱导AS 斑块内皮细胞移行，平滑肌细胞分裂，从而导致血栓斑块形成。JAK/STAT 通路作为众多细胞因子转导的共同途径，在细胞生理病理变化中参与广泛，与AS 密切相关。STAT3 被激活后会通过基因的调节功能促进平滑肌细胞增殖［17］，导致AS的发生。SOCS3作为JAK2/STAT3信号通路的特异性阻断因子之一，其高表达会抑制该通路的正常传导功能，主要通过抗炎和调控细胞凋亡来抑制AS 的发生与发展［18］。李妹娟等［19］研究发现抑制JAK2/STAT3 信号通路后AS 大鼠病理改变得以改善。本次研究显示，模型组JAK2、STAT3、SOCS3、IL-6、IL-1β、MCP-1、TNF-α 较空白对照组均明显提高，证实上述因子在AS发生发展过程中的重要作用。经过活血清热解毒方干预后，JAK2、STAT3、SOCS3、IL-6、IL-1β、MCP-1、TNF-α 均明显降低，IL-10 提示活血清热解毒方在抑制AK2/STAT3 信号通路，调控炎症反应方面具有良好的效果。清热解毒中药大多具有抗炎作用，从而能发挥稳定易损斑块，防止其破裂的作用。

本次研究结果显示，血清热解毒方能够降低AS大鼠模型血脂和炎症因子水平，抑制主动脉斑块的形成，发挥抗粥样硬化的作用，其机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路和SOCS3蛋白表达有关。本次研究不足之处在于仅对雄性大鼠展开研究，未考虑性别对实验结果可能产生的影响，同时血清和蛋白表达检测的样本量偏小，且仅对颈主动脉展开研究，在今后的研究中需要进一步完善。