L-乳酸促进皮下脂肪细胞棕脂分化和产热

赵玲俐, 刘 健, 蔡 皓, 张 弦

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

肥胖是一个全球性的健康问题,可导致慢性代谢性疾病,例如Ⅱ型糖尿病、胰岛素抵抗、动脉粥样硬化和非酒精性脂肪肝等[1]。长期的能量摄入和能量消耗的不平衡导致脂肪积累是肥胖发生的根本原因[2-3]。哺乳动物的脂肪细胞主要包括白色、米色和棕色脂肪细胞[4]。米色和棕色脂肪细胞通过线粒体解偶联蛋白1(UCP1)将化学能直接转化成热能维持机体的体温。当白色脂肪细胞受到β-肾上腺素或者寒冷环境等刺激时会分化为具有部分棕色脂肪细胞表型特征的米色脂肪细胞,例如胞内的脂滴变小、线粒体增多和UCP1蛋白表达量增加[5-6]。目前,促进脂肪细胞棕脂化和增强脂肪组织产热能力被认为是改善肥胖有效的手段[7]。

众所周知,适度的运动有益于机体健康[8]。适度的运动可以促进脂肪组织棕脂化,提高机体能量代谢[9];同时,适度的运动也会造成血浆中乳酸浓度的适度升高,在正常人和小鼠体内,血浆乳酸浓度在0.5～2.0 mmol/L,而在适度有氧运动期间血浆中的乳酸浓度大约会增加到4 mmol/L[10-12]。这些研究表明乳酸浓度的升高可能与脂肪组织产热增强相关。

文献[13]报道了腹腔注射L-乳酸并且配合过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)激动剂罗格列酮可以促进小鼠白色脂肪组织产热,25 mmol/L的L-乳酸通过激活PPARγ信号促进脂肪细胞棕脂化。此外,文献[14-15]报道了在饲料中添加乳酸,通过激活G蛋白偶联受体81(GPR81),调控p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK),促进小鼠白色脂肪组织产热,25 mmol/L的乳酸处理分化后的3T3-L1脂肪细胞48 h可以明显促进细胞中UCP1蛋白表达。然而,25 mmol/L的乳酸水平远远超过了运动后机体血浆中的乳酸水平。与适度运动后血浆中乳酸浓度相当浓度的乳酸对于脂肪细胞棕脂分化的影响还不清楚。AMP-活化蛋白激酶(AMPK)信号作为一种能量敏感分子,当细胞能量状态受到损害时,AMPK通过分解代谢途径刺激能量生成,同时减少非必需的能量消耗途径来恢复能量稳态,它同样可以参与调控棕色和米色脂肪细胞的分化和功能[16-17]。乳酸在促进能量代谢过程中是否需要AMPK的参与值得进一步的考察。

因此,本文采用与适度运动后血浆中乳酸浓度相当浓度的乳酸,在皮下脂肪细胞棕脂分化过程中和分化成熟后进行处理,探究皮下脂肪细胞产热基因mRNA和关键蛋白UCP1表达水平,并考察在此浓度下AMPK是否参与乳酸调控皮下脂肪细胞产热过程。实验结果显示,L-乳酸添加通过AMPK促进了皮下脂肪细胞产热。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

本实验所用L-乳酸钠、胶原酶、地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、胰岛素、罗格列酮和三碘甲状腺原氨酸(T3)均购自Sigma公司;RNAiso Plus RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒和SYBR Green Mixture均购自Takara公司; UCP1、AMPK和p-AMPK抗体和辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG均购自Cell Signaling Technology公司;DMEM粉末、胎牛血清(FBS)和青链霉素双抗溶液均购自Gibco公司;碳酸氢钠、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾等均均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 皮下脂肪细胞的分离与分化

从6～8周龄的C57BL/6J小鼠中分离皮下脂肪组织,将组织剪碎后放入消化液(含有1 mg/mL胶原酶,1%的BSA)中,在37 ℃的条件下消化45 min。消化结束后加入2倍消化液体积的DMEM高糖基础培养基(含血清)终止消化;然后用200目滤网过滤。4 ℃,400g,离心5 min,弃上清,加入含有10%FBS的DMEM高糖基础培养基重悬;接着4 ℃,400g离心5 min,重悬后接种到6孔板中。细胞100%融合后,用分化培养基诱导细胞棕脂化,分化培养基由基础培养基添加0.5 μg/mL胰岛素、1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、5 nmol/L T3和1 μmol/L罗格列酮组成,培养2 d后,更换为维持培养基,维持培养基由基础培养基添加0.5 μg/mL胰岛素、5 nmol/L T3和10 μmol/L罗格列酮组成,每2天更换一次培养基,直至第8天。在细胞分化的过程中添加5 mmol/L和10 mmol/L的L-乳酸钠或者在细胞分化结束后,添加5 mmol/L和10 mmol/L的L-乳酸钠处理48 h。

1.3 实时荧光定量PCR检测

根据制造商的说明,使用RNAiso Plus试剂从棕脂细胞中提取总RNA。往细胞中加入300 μL的Trizol,再向含有细胞的Trizol中加入60 μL三氯甲烷,充分震荡后,静置5 min。在4 ℃的条件下,12 000g离心15 min,吸取100 μL的上层无色水相,再加入100 μL异丙醇,充分震荡后,静置10 min。再在4 ℃的条件下,12 000g离心10 min,弃上清。再加入1 mL的75%酒精,4 ℃,12 000g离心5 min,弃上清。加入16 μLDEPC水、4 μL Mix溶解沉淀,充分振荡以溶解RNA,然后4 ℃,5 000g离心2 min。混匀后,在37 ℃条件下反应50 min,再在85 ℃条件下反应10 s得到cDNA。实时荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测系统采用SYBR○R Premix Ex TaqTMⅡ进行。实时荧光定量PCR反应由95 °C变性3 min启动,然后进行35个循环扩增(95 ℃、10 s, 60 ℃、20 s)。采用2-ΔΔCT方法分析β-actin mRNA表达正常化后基因表达的相对变化。

1.4 蛋白提取和Western Blot检测

细胞裂解,在4 ℃下12 000g离心30 min。收集上清液。蛋白质在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶上分离,进行电泳。电泳时间结束后,将聚偏二氟乙烯(PVDF)膜在甲醇中浸泡30 s,放入预冷的转膜缓冲液中,浸泡15 min。然后在三明治夹中依次放上2层滤纸、胶、PVDF膜、2层滤纸,夹紧后,按正负极规定方向放入转膜槽中,2块胶同时转膜200 mA恒流转2 h。转膜完成后,将PVDF膜放入含有5%脱脂奶粉的TBST(洗涤缓冲液)封闭液中,室温下封闭1 h。封闭结束后,将PVDF膜放入装有一抗(参考抗体说明书,按照适当比例用含有5%BSA(牛血清白蛋白)的TBST稀释抗体)的封闭袋中,在4 ℃的条件下孵育过夜。用TBST 漂洗一抗孵育后的PVDF膜,然后将膜转移至装有辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(1∶5 000 ～1∶10 000)的封闭袋中,在室温下孵育2 h。使用ECL试剂盒和Image Quant LAS 4 000 mini(GE Healthcare, BS, UK)检测和分析蛋白条带,使用Image QuantTL 7.0软件定量条带信号强度。

1.5 数据分析

所有数据以(平均值±标准差)表示。图形使用Origin 8.5绘制。统计显著性由t检验计算。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 L-乳酸促进细胞分化中产热基因的表达

为了研究L-乳酸对皮下脂肪细胞棕脂分化的影响,实验分离了C57BL/6J小鼠白色脂肪组织中的间质血管组分细胞(SVFs),在其棕脂分化的过程中加入5 mmol/L和10 mmol/L的L-乳酸钠。本文检测了一系列产热基因包括线粒体解偶联蛋白1(Ucp1)、PR结构域蛋白16(Prdm16)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅激活因子1(Pgc1α)和细胞死亡激活因子(Cidea)的表达水平。L-乳酸对棕脂分化过程中产热基因表达的影响如图1所示。

图1 L-乳酸对棕脂分化过程中产热基因表达的影响

从图1可以看出:与未加L-乳酸钠处理组相比,5 mmol/L的L-乳酸钠提高了产热基因Ucp1表达水平,尽管没有显著性差异;10 mmol/L的L-乳酸钠明显促进了产热基因Ucp1的表达。结果表明,L-乳酸处理促进了皮下脂肪细胞的棕脂分化。

2.2 L-乳酸促进细胞分化中UCP1蛋白的表达

UCP1蛋白是棕脂细胞产热过程中的关键蛋白,当电子沿着电子传递链传递时,质子从线粒体内膜基质泵到内膜外侧,内膜外侧的质子可以通过特殊的质子通道UCP1流回线粒体基质中,而不通过ATP合酶,由葡萄糖和脂肪酸分解产生的能量不能转化为ATP而转化为热能,产热基因Prdm16、Pgc1α和Cidea通过Ucp1调控棕脂细胞产热[18]。为了探究L-乳酸的促棕脂化效应,皮下脂肪细胞作为细胞模型,并被不同浓度(5 mmol/L和10 mmol/L)的L-乳酸钠处理。Western Blot检测了皮下脂肪细胞棕脂分化过程中UCP1蛋白表达水平。L-乳酸对棕脂分化过程中UCP1蛋白表达的影响如图2所示,从图2可以看出,5 mmol/L和10 mmol/L的L-乳酸钠都明显促进了皮下脂肪细胞棕脂分化过程中UCP1蛋白表达。这些结果进一步说明了L-乳酸处理促进了皮下脂肪细胞的棕脂分化。

图2 L-乳酸对棕脂分化过程中UCP1蛋白表达的影响

2.3 L-乳酸促进细胞分化中p-AMPK的表达

AMPK是一种细胞能量传感器,最近已被证明在调节棕色和米色脂肪组织的代谢活性方面具有重要意义[17]。为了探究L-乳酸促进棕脂化的可能机制,本文确定了AMPK的表达水平,它也是一个调节脂肪酸利用的代谢主开关。L-乳酸对棕脂分化过程中AMPK磷酸化蛋白表达的影响如图3所示,从图3可以看出,5 mmol/L的L-乳酸钠提高了AMPK蛋白磷酸化水平,尽管没有显著性差异,L-乳酸在较低浓度条件下不能提高皮下脂肪细胞棕脂分化过程中AMPK蛋白磷酸化水平的能力,而1 mmol/L的L-乳酸钠显著增加了AMPK蛋白磷酸化水平。结果表明L-乳酸处理促进皮下脂肪细胞的棕脂分化与AMPK信号通路相关。

图3 L-乳酸对棕脂分化过程中AMPK磷酸化蛋白表达的影响

2.4 L-乳酸促进棕脂细胞中产热基因的表达

L-乳酸促进了皮下脂肪细胞棕脂分化,并且这种促进作用可能与AMPK信号通路相关。随后本文研究了L-乳酸对成熟棕色脂肪细胞产热的影响,使用诱导剂胰岛素、地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、T3和罗格列酮将SVFs诱导为成熟的棕色脂肪细胞后,5 mmol/L和10 mmol/L的L-乳酸钠处理细胞48 h,一系列产热基因Ucp1、Prdm16、Pgc1α和Cidea的表达水平被检测。

L-乳酸对棕脂细胞中产热基因表达的影响如图4所示。从图4可以看出:与未加L-乳酸钠处理组相比,5 mmol/L的L-乳酸钠处理仅显著促进了棕色脂肪细胞中产热基因Ucp1的表达,略微提高了Prdm16、Pgc1α的表达水平,但无显著性差异;10 mmol/L的L-乳酸钠处理显著促进了产热基因Ucp1、Prdm16、Pgc1α和Cidea的表达。结果表明L-乳酸处理促进了成熟棕色脂肪细胞产热。

图4 L-乳酸对棕脂细胞中产热基因表达的影响

2.5 L-乳酸促进棕脂细胞中UCP1的表达

与研究L-乳酸对皮下脂肪细胞棕脂分化的影响一致,本文同样检测了L-乳酸钠处理棕脂细胞48 h后,细胞内UCP1蛋白表达的水平。L-乳酸对棕脂细胞中UCP1蛋白表达的影响如图5所示。

图5 L-乳酸对棕脂细胞中UCP1蛋白表达的影响

从图5可以看出,与L-乳酸对细胞内Ucp1基因表达的影响一致,5 mmol/L和10 mmol/L的L-乳酸钠都明显促进了棕脂细胞中UCP1蛋白表达,即使在较低的浓度条件下,L-乳酸也能促进棕脂细胞中UCP1蛋白表达。5 mmol/L的L-乳酸钠并不能促进皮下脂肪细胞棕脂分化过程中产热蛋白UCP1的表达,表明L-乳酸促进棕脂细胞产热的作用明显优于促进皮下脂肪细胞棕脂分化的作用。这些结果进一步说明了L-乳酸处理促进了棕色脂肪细胞产热。

2.6 L-乳酸促进棕脂细胞中p-AMPK的表达

AMPK不仅在皮下脂肪细胞棕脂分化中发挥重要作用,还可以调控棕色脂肪细胞产热[16]。为了研究L-乳酸促进成熟棕脂细胞产热的机制,用5 mmol/L和10 mmol/L的L-乳酸钠处理棕脂细胞48 h,Western Blot检测棕脂细胞中AMPK和p-AMPK蛋白表达水平。L-乳酸对棕脂细胞中AMPK磷酸化蛋白表达的影响如图6所示。从图6可以看出,与未用L-乳酸钠处理组相比,5 mmol/L和10 mmol/L的L-乳酸钠都显著增加了棕脂细胞中p-AMPK与AMPK蛋白表达比率,即AMPK蛋白的磷酸化水平。结果表明L-乳酸促进成熟棕色脂肪细胞产热也与AMPK信号通路相关。

图6 L-乳酸对棕脂细胞中AMPK磷酸化蛋白表达的影响

3 讨 论

乳酸广泛存在于人体、动物及微生物代谢之中,也存在于多种食品中。乳酸分子存在2种光学对映体(D-乳酸和L-乳酸),在哺乳动物体内L-乳酸是主要的同分异构形式,相比于葡萄糖,由糖酵解产生的L-乳酸是主要的能量载体[19-20]。在适度运动的过程中,血浆中的乳酸浓度大约会增加到4 mmol/L[11-12],为了研究与适度运动后血浆中乳酸浓度相当浓度的乳酸对棕脂细胞分化和产热的影响,本文采用5 mmol/L和10 mmol/L的L-乳酸钠进行研究。

为了研究乳酸在皮下脂肪细胞分化过程和成熟后是否都发挥作用,本文在细胞分化的过程中或者细胞分化结束后加入L-乳酸钠。在这2种情况下,10 mmol/L的L-乳酸钠促进了成熟棕色脂肪细胞中Ucp1、Prdm16、Pgc1α和Cidea产热基因、UCP1蛋白和AMPK磷酸化蛋白的表达,仅促进了棕色脂肪细胞分化过程中Ucp1mRNA、UCP1蛋白和AMPK磷酸化蛋白的表达。5 mmol/L的L-乳酸钠促进了成熟棕色脂肪细胞中Ucp1 mRNA、UCP1蛋白和AMPK磷酸化蛋白的表达,仅促进了棕色脂肪细胞分化过程中UCP1蛋白的表达。结果表明L-乳酸对成熟棕脂细胞产热的促进作用更强于对皮下脂肪细胞棕脂分化的作用。

文献[13]报道了5～50 mmol/L的L-乳酸通过PPARγ信号促进小鼠皮下脂肪组织分化的原代脂肪细胞产热。与前人的研究结果一致,本文同样发现5 mmol/L和10 mmol/L的L-乳酸促进棕脂细胞产热。此外,本文还发现L-乳酸促进了皮下脂肪细胞棕脂分化过程中产热基因和UCP1蛋白的表达。L-乳酸通过AMPK信号在皮下脂肪细胞棕脂分化和棕脂细胞产热过程中发挥作用。这说明L-乳酸可能通过多个信号通路来促进脂肪细胞产热。

本文发现与适度运动后血浆中乳酸浓度相当浓度的L-乳酸处理,既能促进皮下脂肪细胞棕脂分化也能促进成熟棕脂细胞产热。机制研究表明,AMPK信号参与了L-乳酸促进皮下脂肪细胞产热的进程。这些研究结果为乳酸改善机体代谢提供了新的理论依据,并为肥胖及其相关的代谢性疾病提供了一种新的预防和治疗手段。