高强度WPU-CMCh水凝胶的合成及性能研究

杨正旸，吴宇桢，曹树坤，张民伟

（1.新疆大学未来技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046；2.新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046）

水凝胶（Hydrogel）是一类在水中能迅速溶胀而不溶解的亲水三维网络结构。水凝胶的三维网络不仅使得其含水量超过90%，更赋予其类似软组织的弹性，可支持皮肤组织的再生，在辅助缓解疼痛、平衡伤口表面湿度、提供理想的愈合环境、缩短伤口的愈合时间等方面具有突出优势，是临床伤口护理常见的医用敷料之一[1-3]。Zhang等人[4]使用Ca2+、凝血酶激活富血小板血浆 (PRP)和海藻酸钠 (SA) 的纤维蛋白，构建了双网络水凝胶，PRP释放的外源蛋白可增强组织中表皮生长因子 (EGF) 的表达，从而加速伤口愈合。Chen等人[5]基于席夫碱反应（可逆亚胺键），设计了壳聚糖 (CS) 和氧化魔芋葡甘聚糖(OKGM) 的可注射水凝胶，可明显加速损伤组织的再上皮化。CS、OKGM、CMCh等天然高分子材料具有良好的抗菌活性和促进组织再上皮化的能力，但也存在着机械强度不足的缺点，无法为伤口的皮肤组织提供弹性支撑，在四期伤口的临床护理上，需要配合伤口敷料组件支撑架来提高使用效果。这些缺点给水凝胶敷料的推广造成了困扰[6-7]。

理想的伤口敷料应具有抑菌、保湿、支撑等多方面功能，为此我们选择高含固量 (＞60%)的水性聚氨酯(WPU)和羧甲基壳聚糖(CMCh)作为水凝胶原料，开发了一种富有弹性的水性聚氨酯-羧甲基壳聚糖共聚水凝胶（WPU-CMCh）。WPU具有生物相容性好、可生物降解等优点，力学性能优良，但也会导致渗出液较少的伤口过于干燥，不利于伤口恢复甚至造成二次伤害[8-9]。CMCh是壳聚糖(CS)的一种衍生物，保留了CS能促进创面愈合、止血、抑菌的优良性能，同时CMCh中含有大量的-COOH、-NH2、-OH等亲水基团，具有良好的吸涨和保水能力，弥补了CS的溶解度缺陷。本实验在WPU乳液中引入了不同质量分数的CMCh，制备了一系列WPU-CMCh水凝胶，既提高了天然高分子水凝胶的机械强度，又具有抗菌、促进细胞增殖等优点，具有应用于伤口修复的潜力。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

水性聚氨酯 (Waterborne polyurethane，WPU)、羧甲基壳聚糖 (CMCh，取代度≥80%)、丙烯酰胺 (AM)、N,N’-亚甲基双丙烯酰胺 (MBA)、琼脂(分析纯)、过硫酸钾 (KPS，CR)。革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(S.aureus)，革兰氏阴性菌大肠杆菌 (E.coli)。

WDW-5型电子万能测试机，VERTEX-70型傅里叶变换红外光谱仪，U-2900 型紫外可见分光光度计，FJ200型高速分散均质机。

1.2 水性聚氨酯固含量的计算

采用GB 1725-1979[10]的方法测量水性聚氨酯乳液的固含量。将干燥洁净的培养皿称重后，在培养皿中装入水性聚氨酯，于105℃恒温鼓风烘箱中烘至恒重，再称重。固含量 X按式(1)计算：

式中，w为培养皿的质量，g；w1为培养皿和装入的水性聚氨酯的总质量，g；w2是培养皿和风干至恒重的水性聚氨酯质量，g。

1.3 水性聚氨酯-羧甲基壳聚糖水凝胶的合成

参考Yao等人[11]制备聚氨酯水凝胶的方法并略作修改。将10mL水性聚氨酯乳液加入烧杯中，在高速分散（11000r·min-1）状态下，分2次加入5mL的CMCh水溶液，CMCh质量分别为水性聚氨酯固体质量的0%、2%、4%、6%、8%、10%。室温下搅拌30min，混合均匀后，加入0.008g的MBA、2.1g的AM、0.02g的KPS，高速分散20min，然后超声分散30min。将匀浆置于聚四氟乙烯模具中，70℃水浴4h。制备的一系列水凝胶分别命名为WPUCMCh 2%、WPU-CMCh 4%、WPU-CMCh 6%、WPUCMCh 8%、WPU-CMCh 10%。合成配比见表1。

表1 WPU-CMCh水凝胶的合成配比Table 1 Synthetic formula of WPU-CMCh hydrogel

将制备好的水凝胶脱模，置于去离子水中浸泡7d。前3d每隔4h换1次去离子水，后4d每隔1 h换1次去离子水，以彻底去除未反应单体和引发剂。然后在真空条件下冷冻干燥，得到无水的WPUCMCh凝胶。

1.4 测试及表征

1.4.1 水凝胶的溶胀性能测试

将水凝胶在-50℃真空中冻干至恒重，取大小相近、质量相等(m0)的凝胶块，浸泡于去离子水中，每隔4h取出称重(mt)。根据式(2)计算溶胀比 SR：

式中，m0为干凝胶质量，g；mt为t时刻溶胀后WPU-CMCh水凝胶的质量，g。

1.4.2 保水性能测试

将溶胀至恒重(mk)的水凝胶，置于37℃、50%湿度的环境中，每隔3h称重(mt)，直至样品恒重。根据式(3)计算保水率WR：

式中，m0为干凝胶的质量，g。

1.4.3 红外测试

使用傅里叶变换红外光谱仪对水凝胶进行全反射测试。测试范围为4000 cm-1～600 cm-1，扫描次数为32次，分辨率为2 cm-1。

1.4.4 SEM分析

对凝胶样品进行冷冻干燥处理，在截面喷镀后贴在导电胶上，用场发射扫描电镜，以 5 kV 的加速电压对凝胶样品进行扫描，观察分析其微观形貌。

1.4.5 水凝胶压缩力学性能的测试

将在去离子水中浸泡至恒重的水凝胶制成10mm3的立方块，进行压缩力学性能测试，压缩速率为20mm·min-1，每个样品测试3次，取平均值。

1.4.6 抗菌性能测试

理想的伤口敷料应具有良好的抗菌性，以抑制伤口表面细菌的繁殖，减少伤口炎症[12]。为此，本研究用革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌 (S.aureus)与革兰氏阴性菌大肠杆菌 (E.coil) 来测试水凝胶的抗菌性能。将尺寸为20mm×20mm×10mm的水凝胶覆盖在培养基表面，37℃下培养 24h，观察有无抑菌圈产生，以及覆盖面的细菌生长状态。

1.4.7 细胞毒性实验

制备水凝胶浸提液[13]，称取已消毒的一系列WPU-CMCh水凝胶各0.2 g，按照 GB/T 16886.5-2017[14]，加入1mL完全培养基，在37℃培养箱中静置24 h。在96孔细胞培养板中接种L929细胞，细胞密度为1×104个·mL-1。每孔加入100μL水凝胶浸提液，放置于培养箱中培养24h。使用MTT显色，检测490nm处的OD值，计算细胞活性。

2 结果与讨论

2.1 溶胀性能分析

水凝胶的溶胀过程是WPU-CMCh分子链网络的膨胀过程，经过物理扩散、氢键形成、静电斥力增强、静电斥力抵消4个阶段，水凝胶达到溶胀平衡[15-16]。溶胀平衡是水凝胶的一个重要特征，在评估水凝胶敷料的物理性质时，溶胀和保水是与伤口愈合相关的重要参数。溶胀比是凝胶达到平衡时的前后体积之比，反映了水凝胶的吸水能力，溶胀比高的水凝胶在伤口愈合后期可及时吸收伤口渗出液，避免成纤维细胞的迁移受到渗出液中的负调控因子TGF-β的影响，导致伤口的愈合时间延长[17]。

图1是WPU-CMCh水凝胶的溶胀性能。溶胀初期，水凝胶处于物理扩散阶段，水分子不受分子链束缚，凝胶的吸水速率快；约12h后，吸水速率降低，水凝胶中的-OH、-NH2、-COOH等亲水基团与水分子形成氢键，提高了对水的亲和力；约108 h时，-COOH、-OH等亲水基团解离后产生的静电斥力使得分子链网络扩张；同时，分子链的弹性收缩力也增大，抵消了静电斥力，凝胶体系达到溶胀平衡。

图1 WPU-CMCh水凝胶的溶胀比随时间的变化情况Fig.1 Changing curves of swelling ratio in WPU-CMCh hydrogels

由于CMCh中富含-OH、-NH2、-COOH等亲水基团，凝胶体系达到平衡的时间和溶胀比（SR），均随CMCh添加量的增加而提高，CMCh的添加量达到10%时，SR超过9。一方面，CMCh上大量的亲水基团与水形成氢键，提高了凝胶的吸水能力，使凝胶的溶胀性能得到提高；另一方面，CMCh的引入改变了WPU紧密的分子链交缠，同时增加了分子链的柔性，从而提高了水凝胶平衡时的溶胀比[18]。WPU-CMCh凝胶具有较好的吸涨能力，在吸收伤口渗出液方面预计会有良好表现。

2.2 保水性能分析

湿润环境可以促进上皮细胞的迁移，湿创面的上皮细胞，其迁移速度比干创面更快。水凝胶良好的保水能力可以为伤口愈合提供湿润的环境，提高伤口愈合效率，因此有必要进行保水实验，以初步评价水凝胶保持伤口湿度的能力[19-20]。

图2是WPU-CMCh水凝胶的保水性能。从图2可知，WPU-CMCh水凝胶的含水量随时间的延长而减少，干燥过程大致分为3个阶段，符合干燥动力学曲线[21]。干燥初期，凝胶内部的自由水多，表面水分气化以及水分子的扩散速率高；第二阶段，内部水分子的扩散速率降低，扩散速率小于蒸发速率，凝胶的干燥速率降低。同时，CMCh的亲水性降低了材料内水分子的扩散速度，提高了材料的保水能力，相比WPU-CMCh 0%水凝胶，引入CMCh的水凝胶具有更好的保水能力。78 h时，水凝胶的保水率仍有20%左右，材料的保水性能良好，可为伤口的愈合提供较长时间的湿润环境。

图2 WPU-CMCh水凝胶的保水性能Fig.2 Weight retention capacity of WBPU-CMCh hydrogels

2.3 红外光谱分析

为探究WPU-CMCh水凝胶的形成机制，采用红外光谱对其进行了表征。WPU-CMCh水凝胶是由WPU的氨基(-NH2)与CMCh的羧基(-COOH)发生缩合反应形成的席夫碱键交联而成的凝胶网络结构[22]。

图3 是CMCh、WPU、WPU-CMCh 8%及WPUCMCh 10%的红外光谱图。3500cm-1～3100 cm-1为-N-H的伸缩振动峰，1750 cm-1～1706 cm-1为-C=O的吸收峰，1690 cm-1～1640 cm-1为-C=N的吸收峰。WPU-CMCh 8%和WPU-CMCh 10%的红外光谱图中，CMCh的引入导致1731 cm-1处的吸收峰消失，1658 cm-1和1612 cm-1处的吸收峰增强，说明形成了-C=N，且CMCh与WPU完全反应形成了化学交联。CMCh添加量为10%时，1735 cm-1处的吸收峰再次出现，1669.39 cm-1处的吸收峰增强，CMCh过量添加时，部分羧基未发生交联。此外，红外光谱显示，3354 cm-1处-N-H的吸收峰减弱，表明WPU与CMCh发生了席夫碱反应形成了化学交联。席夫碱具有杀菌、抑菌、抗病毒等生物活性，可以提高材料的抗菌能力，化学交联网络的形成赋予了水凝胶良好的保水能力[23-24]。

图3 CMCh、WPU、WPU-CMCh 8%、WPU-CMCh 10%的红外光谱图Fig.3 FTIR spectra of CMCh, WPU, WPU-CMCh 8% and WPU-CMCh 10%

2.4 SEM分析

水凝胶的比表面积会影响凝胶的溶胀速率，比表面积因内部孔隙的增加而提高[25]。将溶胀至平衡的水凝胶冷冻干燥后，用场发射扫描电子显微镜观察其内部的微观形貌，结果见图4。

图4 WPU-CMCh水凝胶的SEM分析Fig.4 SEM of WBPU-CMCh hydrogels

由图4可以看出，WPU-CMCh水凝胶具有连续的网状结构，内部均匀散布着大量孔结构。CMCh的含量影响孔隙直径和形态，随着CMCh的添加量增加，微孔数量呈增加的趋势。CMCh从0%增加至8%时，WPU和CMCh形成了席夫碱键，且有机高分子链间的缠结增加，提高了凝胶的交联程度，凝胶内部的网状结构由疏松变得致密，凝胶孔隙的直径减小，数量增加。但CMCh的添加量达到10%时，WPU-CMCh 10%水凝胶内部致密的孔隙结构被破坏，内部出现疏松不规则的大孔。红外分析结果(图3)表明，疏松不规则的大孔可能是CMCh过量添加后，未反应的CMCh破坏了水凝胶的致密结构，导致凝胶内部出现了过大的孔隙。SEM结果显示，水凝胶内部形成了丰富的孔隙结构，这种网状结构允许水、伤口分泌物、抗菌颗粒等物质在凝胶内扩散运输，并赋予水凝胶一定的弹性。这样的多孔凝胶将是一种理想的伤口敷料[26]。

2.5 压缩力学性能分析

交联方式、交联程度、材料种类等，都会影响水凝胶的机械强度。Chen等人[27]发现，脱乙酰程度决定了壳聚糖形成的氢键数量，从而影响材料的机械强度。Chang等人[28]将纳米材料作为增强剂，以提高聚合物水凝胶的机械强度和稳定性。CMCh通过席夫碱反应形成的水凝胶，机械强度不足，稳定性差[29]，为此我们期望WPU的加入可以改善水凝胶的机械性能，扩展水凝胶材料的应用场景。

图5是不同WPU-CMCh水凝胶的压缩曲线。水凝胶的压缩形变曲线表明，WPU-CMCh水凝胶具有良好的机械性能和稳定性，其压缩强度均大于1.7 MPa。在已报道的文献中，通过席夫碱形成的CMCh水凝胶，其压缩强度不足0.5 MPa；物理交联型聚氨酯水凝胶及聚氨酯-聚乙烯水凝胶的压缩强度不足1.5 MPa。本研究中，水凝胶的机械性能得到了提高，一方面得益于WPU的加入，另一方面是WPU与CMCh化学交联的形成，改善了水凝胶的机械性能[30]。从图5可知，CMCh的添加量分别为6%和8%时，水凝胶的压缩强度达到2.9 MPa；当CMCh含量为10%时，压缩强度下降至2.1MPa。原因可能是WPU-CMCh 10%水凝胶达到溶胀平衡时的SR约为10，含水量高，席夫碱反应属于可逆反应，水是席夫碱反应的产物，过量积累使得反应向逆反应方向进行，会影响席夫碱键的稳定性，进而影响材料的压缩强度。

图5 不同WPU-CMCh水凝胶的压缩曲线Fig.5 Compression curves of WPU-CMCh hydrogels

2.6 抗菌性能

理想的医用敷料应具有良好的抗菌活性，以保护伤口免受外部细菌侵害，预防患者伤口感染并减少炎症的发生[31]。本实验采用革兰氏阴性菌大肠杆菌(E.coli) 和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(S.aureu)来测试水凝胶的抗菌性能。

图6、图7是不同浓度的WPU-CMCh水凝胶对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(S.aureus)和革兰氏阴性菌大肠杆菌(E.coli)的抗菌效果。对金黄色葡萄球菌，凝胶表现出良好的抗菌效果，覆盖区域无细菌繁殖，表明材料对金黄色葡萄球菌的生长有抑制效果。对大肠杆菌，CMCh的添加量为4%时，材料表现出明显的抗菌效果。材料的抗菌活性一方面是基于席夫碱键的抗菌性，另一方面得益于CMCh的抗菌性。由于CMCh与WPU的分子链形成了交联，因此有抗菌活性的CMCh无法被释放，材料表现出非溶出型抗菌剂的效果。

图6 WPU-CMCh水凝胶对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的抗菌性能Fig.6 Antimicrobial properties of WPU-CMCh hydrogels against S.aureus

图7 WPU-CMCh水凝胶对革兰氏阴性菌大肠杆菌的抗菌性能Fig.7 Antimicrobial properties of WPU-CMCh hydrogels against E.coli

2.7 细胞毒性分析

伤口敷料直接与生物破损表皮接触，因此要具有尽可能高的生物相容性[32]。WPU-CMCh的细胞存活率见图8。整个培养期间，所有样品的细胞存活率均高于90%，可归为0级(无毒)，具有应用于临床伤口护理的潜力。随着CMCh的用量增加，样品的细胞成活率明显增加，其中WPU-CMCh4%、WPU-CMCh6%、WPU-CMCh8%、WPU-CMCh10%在孵育期间的细胞成活率，均高于对照组，说明引入CMCh可促进细胞生长，且不会产生额外的细胞毒性。这一研究结果与前人一致，证实CMCh对细胞的粘附、生长、增殖和分化具有积极作用[33]。

图8 WPU-CMCh水凝胶浸提液的细胞活性Fig.8 Cell viability of WPU-CMCh hydrogels

3 结论

本实验基于席夫碱反应，开发了一种机械性能优良的抗菌水凝胶。以水性聚氨酯 (WPU) 和羧甲基壳聚糖 (CMCh) 为成胶材料，简化制备方法的同时提高了水凝胶的理化性能。红外光谱结果证明，WPU与CMCh通过席夫碱反应形成了化学交联网络，成功合成了共聚水凝胶[35]。WPU提高了水凝胶的机械强度，材料的压缩强度均高于1.7 MPa，CMCh的添加量为WPU固含量的8%时，水凝胶的力学性能最佳，压缩强度达到2.9MPa，可为伤口提供支撑。

进一步的研究表明，WPU-CMCh水凝胶的化学性能与CMCh密切相关。CMCh提高了材料的溶胀和保水能力，能够吸收创面渗出物[36]。WPU-CMCh水凝胶还对革兰氏阴性菌大肠杆菌 (E.coli) 与革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌 (S.aureus) 表现出良好的抗菌活性，可有效减少伤口的细菌感染。细胞毒性实验结果表明，水凝胶具有生物安全性，且对细胞增殖具有一定的促进作用。综上所述，本实验制备的WPU-CMCh水凝胶，在吸水、保水、抗菌、抗压缩等方面均表现良好，具有应用于临床伤口护理的潜力。