m6A修饰调控circRNA 的研究进展

杨志梅,梁成成,张殿琦,李雪峰,昝林森,2*

(1.西北农林科技大学动物科技学院,杨凌 712100;2.国家肉牛改良中心,杨凌 712100)

非编码RNA(long non-coding RNA、micro-RNA、circRNA)作为转录后重要的调控因子,参与多种生物代谢过程。1976年环状RNA首次作为类病毒被报道,并于1979年首次用电子显微镜在人类HeLa细胞中观察到[1-2]。CircRNA由pre-RNA通过反向剪接使5′尾端和3′polyA端通过共价结合的形式形成环状RNA,通常由100到4 000个核苷酸组成的,包含2到5个的外显子,它们主要存在于真核生物的细胞质中[3-4]。在非编码RNA研究早期,由于circRNA在细胞中的表达量少,被人们认为是转录“噪音”而忽视。现随着circRNA各方面技术的成熟,大量的circRNA作为真核生物蛋白编码基因的产物被发现。此外,circRNAs可以作为信使,在不同的组织、发育阶段和细胞条件下携带不同类型的时空生物信息。circRNA具有序列保守性、时序表达特异性和组织表达特异性,相较于mRNA有更强的稳定性,不易被RNase降解[3]。

早在1970年,m6A就已被报道。同DNA和组蛋白的甲基化一样,细胞中的m6A修饰是一个动态可逆过程,受到多种蛋白的调节,包括甲基转移酶复合物(writers)、m6A去甲基酶(erasers)和m6A阅读蛋白(readers)[5]。m6A修饰的发生是RNA的腺嘌呤核苷第6位氮原子发生甲基化。m6A作为主要的表观遗传修饰,其在真核生物中广泛存在,并且参与机体生物各个生物学过程[6]。近几年报道m6A也影响circRNA的稳定性、翻译、出核以及circRNA的免疫反应等过程,同时circRNA也可以通过影响甲基转移酶、去甲基酶以及阅读蛋白进而调控m6A修饰[7-9]。本文阐述了circRNA的生物学合成、作用机制及m6A修饰对circRNA的调控作用,以期为研究circRNA提供新的思路。

1 circRNA的生物合成机制

在真核生物中,pre-mRNA会经历一个去除内含子并将外显子连接成mRNA 的“规范剪接”过程。circRNA的形成与mRNA形成类似,pre-mRNA通过“反向剪接”形成共价环状RNA[10]。环状RNA的形成可与pre-mRNA的“规范剪接”在先后顺序上相互竞争,且这种竞争存在组织特异性和物种保守性[11]。现已发现有3种机制可以驱动环状RNA的形成,即套索驱动环化、内含子驱动环化和RNA结合蛋白(RNA-bindings proteins, RBPs)驱动环化。CircRNA可由外显子和内含子产生,即外显子产生的称为外显子RNA(ecRNA),内含子产生的为内含子RNA(ciRNA),外显子和内含子共同产生的为外显子-内含子RNA(ElciRNA),ecRNA和ciRNA主要存在于细胞质中而 ElciRNA 主要存在于细胞核中[12-13]。

1.1 套索驱动环化

外显子套索环化形成的机制有两种。一是在RNA转录过程中,部分RNA发生折叠,相邻的外显子5′供体和3′受体结合形成套索结构,套索结构形成后将内含子剪切,最终形成包含2或3个外显子的环状RNA[14]。二是pre-mRNA相邻的两个内含子互补配对,进而拉近相应外显子的距离,使得外显子5′供体和3′受体结合形成套索结构,再剪切内含子,最终形成circRNA。这些被剪切后的内含子会被外切酶降解。然而,当pre-mRNA的一个外显子附近有富含7 nt鸟嘌呤(G)和尿嘧啶(U)的序列、另一个外显子附近富含11 nt胞嘧啶(C)的序列时,在套索驱动的环化反应中,内含子可以避免被降解并环化形成环状RNA[15]。酵母基因组很少有重复序列,因此套索驱动环化是酵母基因组环状RNA形成的主要机制。在酵母基因Mrsp1中,已经证明环状RNA是由套索驱动形成的[16]。

1.2 内含子驱动环化

内含子含有反向互补的顺式作用元件,如ALU序列,通过碱基互补直接配对,使pre-mRNA的剪接位点在空间上相互靠近,形成不去内含子的ElciRNA或去内含子的ecRNA。Jeck等[12]首次发现,哺乳动物circRNA中有重复片段ALU,特别是在反方向上富集,因此推测内含子重复片段ALU促进RNA环化。其后Kramer等[17]发现果蝇laccase2 基因的环化受内含子重复序列ALU和反式剪接因子调控。进一步为内含子重复片段促进RNA环化提供证据。后研究又证实circRNA的形成主要由侧翼内含子ALU序列决定,破坏ALU序列的碱基配对可抑制环状RNA的生成[18]。内含子包含多个重复序列,存在碱基配对竞争性,因此内含子重复序列不总驱动环化[19]。其次只有不同内含子的重复序列发生碱基配对才能产生环状RNA,单个内含子内部发生碱基配对时会发生“规范剪接”产生线性RNA[19]。

1.3 RNA结合蛋白(RNA-binding proteins, RBPs)驱动环化

RBPs可以识别并锚定内含子中的特定基因序列,并通过蛋白质相互作用或形成二聚体,在附近的外显子两端形成剪接位点,使剪接受体和剪接供体之间共价连接[20]。Quaking (QKI)属于含有KH结构域的RNA结合蛋白STAR家族,能够结合单个RNA分子的两个区域,因此QKI可以使pre-mRNA外显子靠近形成环状RNA[21]。在上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition ,EMT)过程中,Conn等[20]发现许多环状RNA的形成主要由 QKI调控,QKI与位于pre-mRNA剪接位点附近的识别元件结合形成二聚体,从而诱导环状RNA的形成。与QKI类似的是Drosophila Muscleblind (MBL)蛋白,MBL蛋白同样与自身pre-mRNA中的内含子识别元件特异性结合,拉近剪接位点的距离,以促进环状RNA的产生,从而内源性调节宿主基因的表达[11]。除RBPs驱动环化的作用外,RBPs还可作用于内含子重复序列,抑制环状RNA的生成。NF90/NF110和 RNA解旋酶(DHX9)作用于内含子并且以 “中间体”的形式招募RNA腺苷脱氨酶(ADAR),ADAR使腺苷转化为肌苷,从而影响环状RNA的形成[22]。

2 circRNA的作用机制

2.1 circRNA海绵miRNA

circRNA的功能之一是海绵miRNA,形成circRNA-miRNA-mRNA的竞争性内源RNA网络(competing endogenous RNA, ceRNA),直接或间接调控靶基因[23]。成熟的miRNA通常在细胞质中形成RNA诱导沉默复合物(RISC),与靶标mRNA的3′UTR碱基配对,影响mRNA的稳定性,抑制其翻译。CircRNA 可作为miRNA的“海绵”吸附miRNA从而间接调控靶基因的表达[24]。circRNA-miRNA-mRNA形成的ceRNA网络广泛存在各种真核生物中。研究表明拟南芥中检测到5%的circRNA具有海绵miRNA的能力[25]。水稻中约25%的circRNA海绵miRNA[26],玉米中约20%的circRNA海绵miRNA[27]。同样地,circRNA在动物生长发育中也多发挥海绵作用(表1)。前体脂肪细胞的分化是影响动物脂肪沉积的主要因素,Wang等[28]利用高通量测序技术在前体脂肪细胞分化0和3 d筛选出141个表达差异的circRNAs,并且发现circ-PLXNA1通过海绵miR-214调控动物脂肪细胞的分化。肌肉组织是机体最丰富的组织,约占总体重的50%。肌细胞的增殖、分化是影响肌肉组织生长发育的主要因素。Yan等[29]发现,bta-circ-03789-1以及 bta-circ-05453-1通过海绵miRNA调控肉牛背长肌的发育。

表1 circRNA的功能:海绵miRNA

2.2 与RNA结合蛋白相互作用

RBPs在基因表达中发挥关键作用,参与组织发育和紊乱。RBPs组装核糖核蛋白(RNP)复合物,与特定的顺式调控元件相互作用,从而结合RNA序列并影响RNA的表达和功能[43]。RBPs可以与circRNA相互作用,并在circRNA剪接、加工、折叠、稳定和定位中发挥作用[44]。MBL可以触发补体激活和抗原调理。circMBL侧翼内含子中含有保守的MBL结合位点。因此MBL结合蛋白可以和circMBL结合,影响circMBL外显子的环化率。反过来,circMBL的表达异常会影响 MBL的靶mRNA的形成,并调节亲本基因的转录[11]。含有双链RNA结合域的免疫因子NF90/NF110结合域是circRNA生物发生的关键调节因子。NF90/NF110通过与内含子RNA相互作用促进细胞核中环状RNA的产生,同时NF90/NF110也与细胞质中的成熟环状RNA相互作用动态调控circRNA的稳定[22]。Li等[22]研究表明,病毒感染细胞后,环状RNA表达降低,部分原因是NF90/NF110核输出到细胞质从而影响到circRNA的生成。circRNA可以竞争性地与RBPs结合,通过充当RBPs的海绵、RBPs组装平台和超级转运体连接的特定成分而调节RBPs功能[45]。在细胞周期进程中,CDK2与周期蛋白A(Cyclin A)和周期蛋白E(Cyclin E)相互作用以促进细胞周期的进入,p21则抑制CDK2和Cyclin A、Cyclin E的相互作用并阻止细胞周期进程。circ-Foxo3的异常表达可以结合 CDK2和p21形成circ-Foxo3-p21-CDK2三元复合物,因此阻碍了CDK2的功能并抑制细胞周期进程[46]。丙酮酸激酶作为糖酵解的三大限速酶之一包括了4种同工酶,其中m2型丙酮酸激酶 (PKM2)主要表达于快速增殖的细胞。赖氨酸去甲基化酶8 (lysine demethylase 8, KDM8)可直接与PKM2相互作用,诱导PKM2二聚体调控糖代谢[47-48]。Song等[49]发现,过表达ZCRB1促进ALU介导的circHEATR5B的形成。此外,circHEATR5B编码的新蛋白HEATR5B-881aa可以直接和赖氨酸去甲基化酶8的同源物 JMJD5相互作用。敲除JMJD5可增加PKM2的活性,抑制糖酵解和GBM细胞的增殖。

2.3 circRNA翻译作用

核糖体扫描机制假说认为mRNA的翻译是由eIF4F复合物启动的帽依赖翻译。CircRNA呈环状,无3′polyA和5′帽端,因此被认为不参与RNA的翻译。之后随着翻译需要内部核糖体进入位点(IRES)及circRNA存在IRES位点的发现,说明circRNA可以被翻译。circRNA上的IRES位点可以直接被eIF4G蛋白识别从而启动翻译。在此基础上,许多研究表明,当5′帽依赖的起始机制被阻断时,IRESs也可以翻译特定类型的mRNA[50]。IRES依赖机制在翻译过程中发挥作用的同时也受到IRES反式作用因子(ITAF)和特定蛋白质的调控[51],Yang等[52]发现P27的TP53调节器TRMP(TP53-regulated modulator of p27, TRMP)通过竞争p27 mRNA与多聚嘧啶区结合蛋白1 (PTBP1)的结合来抑制依赖IRES p27的翻译。不存在IRES的circRNA有一个相同的序列“RACH”(R=G、A;H=A、C、U),RACH中含有m6A修饰结构,YTHDF3可以识别m6A修饰位点并能招募eIF4G2到m6A从而起始circRNA翻译[53]。同线性RNA一样,circRNA能编码出有独立功能的蛋白质[54]。circZNF609在人和小鼠肌肉发育中差异性表达,并且具有物种保守性。circZNF609含有从起始密码子开始到终止密码子结束的753 nt开放阅读框,可以通过IRES起始翻译,编码蛋白质[55-56]。circ-AKT3可以编码一个由174个氨基酸组成的蛋白质AKT3-1744aa,该蛋白质在BMC细胞中可发挥作用,当过表达AKT3-174aa时,抑制BMC细胞的增殖,辐射抗性等[54]。circPPP1R12A同样含有216 nt开放阅读框,可以编码出一个由74个氨基酸组成的蛋白质circPPP1R12A-73aa,该蛋白质可促进结肠癌细胞的增殖和代谢[56]。

2.4 circRNA转录作用

非编码RNA的一个中心作用是调控基因表达。EciRNA位于细胞核中能与U1 snRNP相互作用形成RNA-RNA复合物,该复合物能与亲本基因启动子上的Pol II转录复合物相互作用而调控亲本基因的转录[57]。其次在细胞核中,circRNA可以与亲本基因形成RNA-DNA杂交链或R-loop环进而调控宿主基因的表达。Conn等[58]报道拟南芥中来源于SEPALLATA3 第6个外显子的环状RNA可与同源的DNA位点形成R-loop环导致亲本基因转录终止。而线性RNA与同源DNA的结合力很弱。Xu等[59]发现,circSMARCA5在乳腺癌细胞系和乳腺癌样本中表达明显降低,且circSMARCA5是直接与宿主基因形成R-loop环导致宿主基因第15个外显子的转录终止,而非其他研究所述是作为miRNA的海绵发挥作用的。Feng等[60]发现,circ0005276和靶基因XIAP在前列腺癌样中表达上调,circ0005276可以正向调控XIAP的表达并且circ0005276和XIAP能以协同作用促进前列腺癌细胞的增殖、迁移等。其次在机制上,Feng等[60]研究认为circ0005276与FUS结合蛋白相互作用,从而激活XIAP的转录。Chen 等[61]在肝癌组织中发现一种功能性的circRNA(cia-MAF)可以结合到MAFF启动子上从而招募TIP60复合物到MAFF,促进MAFF表达。

3 m6A修饰

DNA的甲基化已被证明可发挥多种作用。随着2011年RNA表观遗传学的提出,RNA的甲基化逐渐进入大众视野。目前发现RNA的修饰接近170种,这也被认为是“外延组学”[62]。其中m6A是真核生物RNA中最丰富的修饰之一,约占所有修饰的60%。m6A修饰在mRNA、tRNA、rRNA、miRNA 等不同类型的RNA中被证实是转录后的调控标记物[63]。m6A是一种存在于许多真核生物中的可逆转录组修饰。在RNA的翻译、剪接、染色体易位、染色体高度螺旋中起重要作用[64],其次越来越多的研究表明m6A在基因表达、细胞增殖、免疫反应等过程起调控作用[65-67]。随着高通量测序技术的发展,2012年第一次在转录组中检测到m6A。Dominissini等[68]利用m6A-seq技术在超过7 000个基因转录本种检测出超过12 000个m6A修饰位点。m6A修饰位点通常在终止密码子和3′ UTR附近富集,与mRNA 的3′ UTR位点有关联[69]。现有的m6A位点检测技术有RNA甲基化免疫共沉淀(MeRIP)、MAZTER-seq、DART-seq、PA-m6A-seq、miCLIP等。MAZTER-seq和DART-seq技术可以量化单个位点的m6A[70-71]。这些m6A检测技术的发展为m6A修饰提供了重要的技术支撑,同时也为m6A修饰非编码RNA提供重要技术支撑。

3.1 甲基转移酶复合物(writers)

甲基化修饰一般情况下在细胞核中发生,但在一些特殊的情况下也可以在细胞质中发生[72]。甲基化实现的过程是腺苷甲硫氨酸作甲基供体,在甲基复合酶复合物(MTC)的作用下完成。甲基酶复合物的组分有METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429、RBM15/RBM15B、含CCH结构的锌指蛋白(ZC3H13)等。METTL3及METTL14形成一个稳定的二聚体,在哺乳动物体内高度保守[73]。WTAP蛋白作为载体,在KIAA1429、RBM15/RBM15B等蛋白的作用下完成甲基化[74]。METTL3在胚胎发育、精子发生及减数分裂等起重要作用[75-76]。敲除METTL3、METTL1和WATP均可以降低m6A修饰。单个组分对m6A修饰的作用不显著。但这些组分可协同发挥作用。R-loop是核苷酸的三级结构,在DNA复制、染色体分离、免疫球蛋白转化等过程发挥作用。在细胞核中,R-loop是Pol II的重要调节因子[77]。Yang等[78]发现,R-loop存在m6A位点,m6A修饰可影响R-loop的形成和降解。当敲低单个组分YTHDC1时,对R-loop的形成影响很小,然而协同敲除METTL3、METTL14、WTAP等组分时,可以抑制R-loop形成。

3.2 m6A去甲基酶(erasers)

m6A去甲基酶是以亚铁离子为辅助因子,α-酮戊二酸为辅助底物,通过去除甲基基团解除m6A修饰[79]。目前发现的去甲基酶有FTO和ALKBH5等[80]。Jia等[81-82]发现与甲基化脱氧核糖核苷酸相比,FTO对核糖核苷酸具有更高的活性,暗示FTO是RNA中3-甲基尿苷(m3U)的去甲基化酶,随后的研究显示,FTO对mRNA中对m6A的去甲基酶活性更高,因此认为m6A是FTO的真正底物。紧接着Mauer等[83]发现m7G帽附近的m6Am在体内和体外都能被FTO转化为Am,敲除或过表达FTO能有效控制含有m6Am的mRNA丰度,进一步证明m6Am是FTO的首选底物。snRNA包含一个受调控的可逆核苷酸修饰,导致它们以两种不同的甲基异构体m1和m2存在。FTO可以选择性地去甲基m2亚型,调控m1和m2的相对亚型。当FTO被抑制时m2-snRNA水平会升高。高水平m2-snRNA的细胞会发生可变剪接模式的改变[84]。Wu等[85]发现,沉默FTO 后CCNA2和CDK2的m6A水平显著上调,YTHDF2识别并衰减CCNA2和CDK2上的m6A水平导致蛋白表达量降低,从而延缓细胞周期进程抑制脂肪生成。ALKBH5定位在细胞核内,影响mRNA的运输、RNA代谢及核内mRNA的加工因子的组装。敲除ALKBH5,小鼠体内的mRNA 的m6A水平增加[86]。重金属与肿瘤发生相关,Li等[87]发现金属铊会通过METLL3/METTL14/ALKBH5-ATP13A3 a轴增加ATP13A3上的异常m6A修饰从而促进结肠癌的发生。Sun等[88]发现在卵巢癌中过表达ALKBH5会逆转ITGB1 mRNA的m6A修饰,导致ITGB1表达增加。

3.3 m6A阅读蛋白(readers)

m6A读取蛋白主要由YTH域家族构成,在YTH域家族中有两个亚型,分别是YTHDFs、YTHDCs。YTHDFs包含 YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3成员。YTHDF1可以促进mRNA的翻译和通过与起始因子结合促进蛋白的合成[89]。YTHDF2可以通过与mRNA的m6A修饰位点结合招募到mRNA的衰败位点从而诱导转录终止[90]。YTHDF3可以与YTHDF1结合促进mRNA翻译,与YTHDF2结合促进mRNA的降解[91]。YTHDFs包含YTHDC1、YTHDC2成员。YTHDC1主要在细胞运输和RNA剪接方面发挥作用[92]。YTHDC2增强mRNA的翻译效率[92]。除YTH域家族外,m6A读取蛋白还有eIFs和IGFBPs。在癌症研究中,IGFBPs可以识别靶基因SOX2编码序列的m6A修饰位点,抑制SOX2降解。在胰腺癌中,过表达IGFBP2后DNA水平的甲基化修饰减低[93]。eIFs作为重要的起始因子,在基因表达和circRNA翻译中发挥重要作用[94]。

4 m6A修饰调控circRNA

m6A修饰广泛存在于真核生物中,修饰mRNA的剪接、出核、降解以及功能等。在非编码RNA中m6A修饰也逐渐被报道,调控机制依然为“readers、 erasers、writers”。在环状RNA中,m6A通过调控circRNA的出核、翻译、降解以及响应免疫反应发挥作用。

4.1 介导circRNA的出核

CircRNA的剪接发生在细胞核中,然而细胞质中存在大量的circRNA。Zhang等[95]发现,circRNA有和线性RNA相似的核输出机制,通过分析HepG2细胞的环状RNA发现富集在细胞质的环状RNA含有可以被核输出RBPs识别的基序。DDX39家族是进化上保守DExD-box解旋酶的家族成员,参与 pre-mRNA转录、剪接和核输出[96]。Huang等[96]和Shen[97]发现,果蝇的Hel25E及其人类同源物UAP56 (DDX39B)或URH49 (DDX39A) 是circRNA定位的关键调节因子,通过感知成熟circRNA的长度来控制细胞的核输出效率。在线性RNA中,阅读蛋白YTHDC1可以和SRSF3相互作用将m6A修饰的mRNA运送到核输出通道中,调控mRNA的出核反应[92]。此外研究发现,YTHDC1也可促进m6A修饰的环状RNA出核[8]。Chen等[8]发现,YTHDC1可识别细胞核中circNSUN2的m6A位点并促进circNSUN2的核输出。输送到细胞质中的circNSUN2可以和IGF2BP及HMGA2形成circNSUN2-IGF2BP2-HMGA2 的RNA-蛋白三元复合物,增强circNSUN2的稳定性。同样在肝癌细胞(HCC)中METTL3可介导m6A修饰的circHPS5形成。YTHDC1促进了m6A修饰的circHPS5出核,加快HCC的转移[9]。

4.2 介导circRNA的翻译

与IRES翻译机制一样,当m6A存在于5′非翻译区域(5′UTR)时,一个单独的m6A位点被称为“m6A诱导的内部核糖体进入位点(MIRES)”[98]。MIRES和IRES都是RNA5′帽端非独立翻译的依赖因子。在circRNA的翻译中起重要作用。一个单一的m6A位点就足以驱动翻译起始。m6A驱动的翻译需要起始因子eIF4G2和m6A阅读蛋白YTHDF3。这种翻译起始机制会被甲基转移酶METTL3和METTL14增强、脱甲基酶FTO抑制。m6A也具有一定的翻译调节能力[99]。在热休克条件下,YTHDF2可从细胞质转移到细胞核中抑制FTO的功能,从而增加m6A翻译[100]。其次通过多聚体分析技术和质谱技术分析表明,m6A驱动翻译在circRNA中广泛存在[53]。circ-ZNF609包含一个开放阅读框(ORF),依赖MIRES机制起始翻译, YTHDF3和eIF4G2蛋白是介导circ-ZNF609翻译的重要因素。当m6A修饰的两个位点发生突变时, circZNF609的翻译会降低50%[101]。阅读蛋白IGF2BP1可以识别circMAP3K4的m6A位点,并促进其翻译为circMAP3K4-455aa, circMAP3K4-455aa通过泛素-蛋白酶E3连接酶(MIB1)途径降解[102]。

4.3 调控circRNA的降解

CircRNA 是一类闭环RNA,较线性RNA更稳定,不易降解。部分circRNA可通过吸附miRNA后依赖Ago2-切片方式降解[103]。GW182是P-body和RNAi通路中的重要因子,含有ABD(Ago结合域),可以在RNAi通路中与Ago相互作用[104]。Jia等[105]发现,GW182的缺失会导致内源性circRNA转录本的积累,表明GW182可以一种依赖于Ago切片的方式调控circRNA的降解。最近的研究显示m6A修饰的环状RNA可通过YTHDF2-HRSP12-RNase P/MRP 轴被内切核糖核酸酶降解。YTHDF2识别circRNA的m6A位点,HRSP12是一个适配器连接YTHDF2和RNase P/MRP,形成一个YTHDF2-HRSP12-RNase P/MRP复合物[106]。Guo等[107]发现,circ3823上存在m6A修饰位点,阅读蛋白YTHDF3 和去甲基酶ALKBH5与circ3823的表达在HCT116细胞中呈负相关, 推测m6A修饰调控circRNA的降解。Liu等[108]发现,在OA软骨细胞中circRERE下调,而m6A修饰增加,说明中circRERE易于通过YTHDF2-HRSP12-RNase P/MRP轴降解。

4.4 识别并参与circRNA介导的免疫反应

PKR(RNA蛋白酶激活激酶)可以识别小于30bp的短链dsRNAs,并起始免疫反应[108-109]。在机体内,自身会产生一类circRNA,该类circRNA会形成一段16-26bp的dsRNAs,其可以作为双链RNA蛋白酶激活激酶(PKR)的抑制剂去响应免疫反应[110]。有研究显示circRNA较其它化学物质而言,抑制PKR激活的效果可高达103～106 倍,从而降低细胞的免疫反应[110]。研究表明,在自身免疫疾病中,如红斑狼疮等,可检测到环状RNA的表达明显降低、PKR的表达明显升高[111]。哺乳动物自身免疫依赖模式识别受体(PRRs)识别病毒和细菌,RIG-1以及MD5s是机体感知外源核酸的PRRs,其中MD5s识别长链dsRNAs,RIG-1识别短链dsRNAs[112]。在环状RNA的研究中发现,外源导入circRNA可以直接激活RIG-1。但是当这些circRNA被修饰时,激活RIG-1的作用会明显降低。研究发现circRNA被m6A修饰时,可以激活RIG-1但会抑制RIG-1的成丝反应。阅读蛋白YTHDF2通过其N端无序结构域将m6A修饰的RNA引入RIG-1中,进而抑制RIG-1的成丝反应[113-114]。其次YTHDF可以通过N端无序结构域介导circRNA避免自身免疫反应[115]。

①.circRNA的生物合成:pre-RNA通过反向剪接形成circRNA;②.circRNA的生物学功能:海绵miRNA,调控亲本基因表达,翻译成蛋白质;③.circRNA的生物降解: 依赖Ago2-切片方式降解及YTHDF2-HRSP12-RNase P/MRP轴降解①.circRNA biogenesis: CircRNA is formed by pre-RNA via backsplicing;②.Biological function of circRNA: miRNA sponging, transcriptional regulation and translation into proteins;③.Degradation of circRNA: degradation by Ago2-sectioning method and YTHDF2-HRSP12-RNase P/MRP axis 图1 circRNA的生物合成、功能和降解Fig.1 Biogenesis, function and degradation of circRNA

5 结论和展望

CircRNA的生物合成、作用机制和降解已被大量报道,其在细胞增殖、分化、凋亡等多种活动发挥作用。主要作用方式有:作为miRNA的“海绵”;与RBPs相互作用;拥有独特的翻译起始位点起始翻译;参与并调控亲本基因的转录。m6A修饰是真核生物中最广泛的表观修饰之一,其不仅在mRNA中发挥作用,而且在非编码RNA中也发挥功能。在环状RNA中,m6A修饰可以调控circRNA的出核反应,通过MIRES起始翻译,在细胞质中形成YTHDF2-HRSP12-RNase P/MRP 轴介导circRNA降解以及响应机体的免疫反应(图1)。然而关于m6A修饰在环状RNA研究的展开时间较短,m6A修饰在环状RNA调控的具体机制目前并不明确,需要深入探究。且有关甲基化和circRNA的研究主要集中于m6A修饰调控circRNA的代谢,而关于circRNA调控m6A修饰相关蛋白的研究仍有待补充。其次关于circRNA的m6A修饰数据库尚为空缺,需要挖掘补充。

现在最常用的m6A位点检测技术是MeRIP,MeRIP可以实现全基因组范围内m6A的检测,但MeRIP技术做不到单核苷酸定位分析且对样品需求量大,不利于珍贵样品的检测。MAZTER-seq、DART-seq虽可以实现单核苷酸分析,但MAZTER-seq技术只能识别ACA位点的甲基化修饰,而ACA只占DRACH的16%[70]。DART-seq只能识别mRNA的m6A位点,不能识别circRNA的m6A修饰[71]。期待随着测序技术的进步,circRNA的m6A位点检测技术能够在不依赖抗体的情况下实现全基因组检测。