姜黄素在脓毒血症幼鼠急性肾损伤中的炎症调节机制

孙中文 王慧智 徐青雨 时乐祥 张一楠 马宇鹏 吴俊 马志

脓毒血症（Sepsis）是感染导致全身炎症过度反应性综合征，进而引起多功能脏器衰竭，是儿童和成人危重症的常见病因之一[1，2]。其中肾脏是最常受影响的靶器官，大数据分析显示，在儿童脓毒血症相关调查中约40%的患儿存在急性肾损伤（AKI）。目前肾脏替代治疗是主要的治疗方式，有研究表明，有效抑制炎症反应是治疗脓毒血症急性肾损伤的关键，因化疗及免疫治疗价格昂贵，且有效的早期治疗药物效果并不理想，故研究早期有效的治疗药物尤为重要[3，4]。

NF-κB 信号传导通路是一条经典炎症通路，是脓毒血症的重要通路之一[5]。NLRP3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体属于NOD 样受体，是NF-κB 经典炎症信号传导通路的下游因子[2]。Gong 等[6]总结相关文献后指出NLRP3 可以改善脂多糖诱导的脓毒症休克。

姜黄素（Curcumin，Cur）是从植物姜黄的根茎中提取出来的天然药物，大量研究表明，姜黄素有抗炎、抗氧化、抗纤维化、抗肿瘤等作用，具有很大的临床药用价值[7]。但姜黄素是否能成为有效预防及治疗脓毒血症急性肾损伤的药物目前有待研究。本实验通过肾功能及肾损伤检测、病理HE 染色、蛋白免疫印迹法等方法，验证姜黄素在脓毒血症急性肾损伤中的炎症调控作用。

1 材料与方法

1.1 仪器全自动生化分析仪BS200（中国mindray公司）；离心机Sorvall ST40（赛默飞公司）；酶标仪SMP500-18335-ELRO（Molecular Devices 公司）；组织切片机（LEICA RM2235）；超低温离心机（Centrifuge 5804R）；洗板机（深圳雷杜洗板机RT-3000）。

1.2 药物和试剂姜黄素（Solarbio 公司，货号：C7090）；戊巴比妥钠（北京化学试剂，货号：061222）；ELISA 检测试剂盒（合肥莱尔生物科技公司提供）：SD 鼠白细胞介素1β（IL-1β）（货号：LE-B1145）；SD 鼠白细胞介素18（IL-18）（货号：LE-B0380）；SD 鼠（Rat）中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）（货号：LE-B1019）；蛋白抗体（Affinity Bioscience 公司提供）；NF-κB p65 抗体（货号：AF5006）；NLRP3 抗体（货号：AF5006）；Caspase-1 抗体（货号：AF5418）；内参GAPDH（货号：AF7021）；辣根过氧化物酶山羊抗兔（货号：S0001）。

1.3 动物SPF 级SD 雄性幼鼠40 只，体质量（80±20）g，辽宁长生生物技术有限公司提供，生产许可证号SYXK（辽）2020-0001，饲养于牡丹江医学院医药研究中心动物房，温度控制在22℃～25℃，相对湿度50%，昼夜12h 自动切换，自由饮水饮食。本动物实验方法符合牡丹江医学院动物福利和伦理管理委员会要求。

1.4 方法

1.4.1 脓毒血症模型建立 采用盲肠结扎穿刺法（Cecal ligation and puncture，CLP）建立脓毒血症模型[8]。幼鼠术前12h 禁食、不禁水，采用浓度1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剂量为3mL/kg；待麻醉成功后，将其固定于操作台上，术区备皮，碘伏消毒术区2～3 次，铺无菌洞巾，取正中线做一长约1.5cm纵行切口，逐层切开皮肤层、肌层，探查腹腔找到幼鼠末端盲肠，将其夹出腹腔，操作时动作轻柔，避免损伤血管，回盲段至远端1/2 处采用2-0 丝线结扎，保证结扎准确，用7 号针头在回盲段至远端1/2 处贯穿2 次并挤压出约0.1cm 粪便点，沿肠管走形轻柔还纳回腹腔，缝合切口，缝合完毕后碘伏消毒术区，术后分别给予皮下注射生理盐水30mL/kg 体液复苏，并放置于37.0℃水垫上，防止低体温，手术总时间控制在15min 内，术后每6h 给予肌肉注射丁丙诺菲0.05mg/kg 镇痛[8～10]。

术后幼鼠精神萎靡，活动减少，毛发耸立，食欲低下，6h 内未出现死亡，解剖可见肠管充血水肿，腹腔渗液明显增多伴恶臭，肠粘连，即CLP 模型建立成功，根据组织病理学表现及生化指标来判断有无急性肾损伤[8]。见图1。

图1 幼鼠脓毒血症模型建立

1.4.2 分组和处理 随机选取10 只幼鼠，分为假手术组（Sham 组）、模型组（CLP 组）、Cur 高 剂量组（CLP+Cur100mg/kg）、Cur 低剂量组（CLP+Cur 50mg/kg）[11]。其中Sham 组：切开腹部，寻找末端盲肠并夹出，不行盲肠结扎及穿刺，术前1 周每天给予生理盐水2mL，每天灌胃一次。CLP 组：按照盲肠结扎穿刺法建立脓毒血症模型，术前1 周生理盐水2mL 灌胃。Cur 高剂量组、Cur 低剂量组分别术前1 周给予2mL 不同剂量的姜黄素悬浊液灌胃，每天一次，手术操作与CLP 组相同。

1.4.3 样本采集 造模成功24h 后，腹腔注射麻醉，做腹部正中切口，2.5mL 注射器取下腔静脉血1.5mL，静置1h 后，常规离心机3 000 转速，离心15min，取上层血清存于-20℃冰箱备用；取幼鼠左、右肾的上半部分组织浸泡于4%多聚甲醛中用于组织病理学检查，左、右肾下半部分组织存于-80℃冰箱备用。

1.4.4 肾脏组织病理检查（HE 染色）肾脏组织标本浸泡于4%多聚甲醛24h 后，进行组织修剪，常规行脱水、透明、透蜡、石蜡包埋，制作病理切片（切片厚度选择4～6μm）。将切片常规脱蜡、复水、苏木素染色、分化、返蓝、伊红染色、洗涤、脱水透明后封片。在光学显微镜下观察组织病变情况，并拍摄图片。

1.4.5 肾脏功能、炎症因子指标测定 取适量上层血清，采用生化分析仪检测肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）的水平；取适量上层血清采用ELISA 法测NGAL、IL-1β、IL-18 的表达水平，操作严格按照酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒说明书进行，绘制标准曲线，计算浓度值。

1.4.6 蛋白免疫印迹法检测幼鼠肾脏NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 蛋白表达水平 取出适量肾脏组织，加入适量RIPA 裂解液，严格按照蛋白提取步骤提取总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度后，常规制备蛋白样品，按照SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒说明书制胶，加样、电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭、TBST 洗膜，然后分别对应加入稀释后的一抗孵育盒4℃过夜孵育（NF-κB p65，1:1 000 稀释；NLRP3，1:1 000稀释；Caspase-1，1:1 000 稀释；GAPDH，1:1 000），TBST 洗膜、选择对应二抗常温孵育1h（HRP-二抗IgG，1:10 000）、TBST 洗膜、ECL 发光法显色并保存数据，Image J 软件进行混度分析计算相应表达量。

1.5 统计学方法采用SPSS 25.0 软件进行分析，符合正态分布则采用均数±标准差（）表示，两组以上比较采用方差分析，若方差不齐，则采用Welch 分析结果，两两多重比较采用最小显著差值法（Least-significant Difference，LSD），P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 姜黄素干预后幼鼠肾脏病理变化Sham 组肾脏细胞无充血、水肿，无炎性细胞浸润，肾小球、肾小管结构完整，无明显细胞损伤。CLP 组肾小管上皮细胞水肿、变性、脱落，呈“毛刷”样改变，肾小管细胞不完整，管腔可见肾小管上皮脱落物和致密物沉着，肾小球管腔增大明显，周围散在出血点，姜黄素干预组与CLP 组相比，肾小管上皮细胞水肿及管腔扩张程度均有所减轻，细胞完整度更高，炎细胞浸润减少，姜黄素高剂量组减轻更为明显。见图2。

图2 姜黄素干预后幼鼠肾脏病理变化

2.2 各组幼鼠肾功能变化从Scr、BUN、NGAL 浓度结果可以看出，与Sham 组相比，CLP 组Scr、BUN显著增加（P＜0.01）；与CLP 组相比，姜黄素干预组降低明显，并且随着姜黄素浓度增加，降低更加显著，姜黄素干预组与CLP 组比较差异有统计学意义（P＜0.01），姜黄素高浓度组与低浓度组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 不同组别幼鼠肾功能变化（，n=10）

表1 不同组别幼鼠肾功能变化（，n=10）

注：与Sham 组比较，aP＜0.01；与CLP 组比较，bP＜0.01；两组姜黄素干预组比较，cP＜0.01

2.3 各组幼鼠肾脏炎症因子水平变化从血清中IL-1β、IL-18 浓度结果可知，与Sham 组相比，CLP组IL-1β、IL-18 浓度显著增加（P＜0.01）；与CLP组相比，姜黄素干预组降低明显，并且随着姜黄素浓度增加，降低更加显著，姜黄素干预组与CLP 组比较差异有统计学意义（P＜0.01），姜黄素高浓度组与低浓度组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 不同组别幼鼠肾脏炎症因子变化（，n=10，pg/mL）

表2 不同组别幼鼠肾脏炎症因子变化（，n=10，pg/mL）

注：与Sham 组比较，aP＜0.01；与CLP 组比较，bP＜0.01；两组姜黄素干预组比较，cP＜0.01

2.4 NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 在各组幼鼠肾脏组织中的表达相对Sham 组，CLP 组中NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 表达水平显著增高（P＜0.01）；与CLP 组相比，姜黄素干预组NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 表达水平降低较为明显，并且随着姜黄素浓度增加，降低更加显著，姜黄素干预组NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 表达水平与CLP 组比较差异有统计学意义（P＜0.01），姜黄素高浓度组的Caspase-1 表达水平与低浓度组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。姜黄素高浓度组的NF-κB p65、NLRP3 表达水平与低浓度组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。见图3。

图3 不同组别幼鼠NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1 蛋白水平变化

3 讨论

CLP 模型是建立幼鼠脓毒血症模型的“金标准”，该模型模仿儿童坏疽穿孔阑尾炎脓毒症[8]。Scr 与BUN 是检测肾脏功能及损伤的常用指标，也是评价脓毒血症是否有急性肾损伤的参考标准[12]。NGAL 是一种新型肾损伤标志物，最早由Kjeldsen等研究中首先发现，来源于中性粒细胞，是一种分泌型糖蛋白，主要由远曲小管和集合管分泌，最近研究发现，当早期肾小管损伤后，血清和尿液中NGAL 水平明显上升，且与肾损伤显著相关[13]。Jahaj 等[13]认为相对于Scr、BUN，NGAL 可能更适合早期诊断，并且指出NGAL 与感染的严重程度成正比，NGAL 作为脓毒血症急性肾损伤早期指标有较大意义。但NGAL 也存在弊端，其特异性并不理想，如对肿瘤、高血压等疾病，研究发现NGAL区分AKI 和慢性肾病（CKD）的敏感性和特异性有限[13，14]。在急性肾损伤的诊断上应用NGAL 是可行的，其也被用作是否进行连续肾替代治疗的指标之一[15]。

目前NF-κB 经典炎症信号传导通路，脓毒症急性肾损伤相关的NF-κB 激活最终依赖于其抑制剂IκBα 的磷酸化和蛋白酶体降解，利于NF-κB核易位，NF-κB 传导通路的激活和NLRP3 有密切关系[16，17]。对于NLRP3 及炎症小体，当机体受外源性或内源性刺激物刺激，NLRP3 炎症小体被激活后，通过与热蛋白结构域（Pyrindomain，PYD）相结合形成结构域复合物，并驱动Caspase-1 的激活，从而诱导IL-1β 和IL-18 等炎性因子的分泌和成熟[2，18]。IL-1β 和IL-18 又是标志性炎症介质，诱导炎性细胞浸润，最终导致肾损伤，Liu 等[19]在百草枯诱导急性肾损伤模型中表示IL-1β 和IL-18在缺血再灌注、纤维化起关键作用，并和NLRP3-Caspase-1 的激活密切相关。由此可知，NLRP3 主要起到连接蛋白并促进炎症反应的关键作用[16，18]。实验结果中发现CLP 组幼鼠IL-1β 和IL-18 炎症水平明显增加，NLRP3、Caspase-1、NF-κB p65 蛋白相对表达量明显增高，姜黄素干预后这些炎症指标及蛋白含量有了不同程度的减少，并且肾组织形态有了明显改善，可知，姜黄素可能通过下调机体内的IL-1β、IL-18/NLRP3-（Caspase-1）-NF-κB 水平，进一步达到抗炎、抗肾损伤的作用。

综上所述，姜黄素可以抑制机体内NLRP3 的激活，减少Caspase-1 聚集，进一步抑制IL-1β 和IL-18 等炎症因子的释放，降低炎性因子对肾脏的破坏和侵袭作用，改善Scr、BUN、NGAL 的水平，从而缓解幼鼠脓毒血症急性肾损伤的进程，起到保护作用。本研究阐述了姜黄素对肾脏的保护机制，为脓毒血症急性肾损伤的干预提供了新的方法。