水产暂养环境中副溶血性弧菌对重金属与抗生素的抗性研究

＊谢家莹 张红敏,2,3 潘迎捷,2,3 赵勇,2,3 谢庆超,2,3*

（1.上海海洋大学食品学院 上海 201306 2.农业农村部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室（上海） 上海 201306 3.上海海洋大学食品质量安全检测实验室 上海 201306）

随着消费者物质生活水平的不断提高，水产品的鲜活程度在消费环节起到越来越重要的作用。因此提高水产品在暂养环节的成活率及品相是传统批发市场、商超以及新型的网络电商都要重点关注的。但是目前国家对水产养殖环境的水质标准发布于1989年，对于现在的鲜活水产保活手段无法做到有效防控[1-2]。副溶血性弧菌（Vibrio Parahaemolyticus）作为一种定殖肠道的病原菌，时常存在于虾、蟹等海产品中，其所携带的耐药基因随可移动遗传元件（Mobile Genetic Element，MGE）在人体肠道菌群中传播所造成的危害引起高度重视[3]。现在对副溶血性弧菌的耐药性研究发现，其具有的耐药谱非常丰富，对多种常见渔用药具有抗生素抗性，包括常规应用于水产动物养殖的例如喹诺酮类、四环素类渔用药[4-5]，以及氯霉素等禁用药。叶灵琼等[6]对副溶血性弧菌进行耐药研究中发现其在环境源和临床源两种不同来源的菌株中的耐药谱很接近，有可能副溶血性弧菌在水产养殖环节产生了抗生素抗性并通过MGE传播给了致病性的副溶血性弧菌。本研究将评估水产品暂养环境中的化学及生物危害物污染情况，并通过分析分离得到的副溶血型弧菌的16 rDNA分型，以期找到二者的关联性以及相互影响规律。

1.材料与方法

(1)材料与试剂

①材料

暂养水样取自上海市江阳水产市场和东方国际水产中心，共计取样40份，命名为TWA1至TWA40。

②试剂

HPLC级浓硝酸与HPLC级乙酸（上海安谱实验科技股份有限公司），TSB（3% NaCl）培养基与TCBS培养基（北京陆桥技术有限责任公司），HPLC级乙腈（德国Merck公司）。

(2)仪器与设备

iCAP Q电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS）和TSQ Quantum液相色谱质谱联用仪（LC-MS-MS）（美国Thermo Scientific公司）；GG17旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）；隔水式恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）；5331 PCR仪（德国Eppendorf公司）。

(3)方法

①暂养水中六种重金属测定

参考《GB/T 5750.6—2006生活饮用水标准检验方法金属指标》中水样的检测方法：水样用浓硝酸配制成1%硝酸溶液后，由ICP-MS测定铅、镉、汞、砷、钠、硼六种元素含量。

②暂养水中氨苄西林测定

A.暂养水中氨苄西林测定前处理

取水样5mL置于50mL离心管中，加入20mL乙腈，使用均质器均质1min后再用离心机在10000r/min，4℃离心10min，把上层提取液移至另一离心管中。再用10mL乙腈重复提取一次，合并两次的提取液，并向离心管中加入10mL乙腈饱和的正己烷，旋涡振荡1min，弃掉上层。把下层提取液移至150mL鸡心瓶中，在40℃旋转蒸发近干。加入2mL超纯水溶解残渣，超声混匀1min后，过0.22μm滤膜，供LC-MS-MS测定。

③暂养水中副溶血性弧菌测定、毒力基因及16S rDNA测序

参考《GB 4789.7—2013食品安全国家标准 食品微生物学检验 副溶血性弧菌检验》中的方法，对样品中副溶血性弧菌进行分离并富集培养，将分离得到的菌株进行甘油管保藏。使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取阳性样品菌株DNA，并用PCR进行16S rDNA和毒力基因tdh、trh、tlh扩增。得到的PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，经过blast比对确认其是目的片段。

(4)统计分析

使用Oringin 9.1对数据进行分析做图。

2.结果与分析

(1)暂养水中六种重金属测定结果

从图1可以看出，暂养水中铅、镉、汞、砷含量均低于标准限量值，而钠的含量最高达到1224mg/mL，总计有27个（67.5%）样品高于饮用水标准中200mg/mL的限量。而硼含量则有两个超过标准中500ng/mL的限量值，其中TWA5达到850.6ng/mL，TWA7达到857.5ng/mL，浓度排第三的TWA31则只有372.7ng/mL，说明前两个硼含量远高于其他样品。

图1 暂养水中六种重金属浓度(a)Pb, Cd, Hg, As; (b)Na, BFig.1 Concentration of six heavy metals in temporary water

(2)暂养水中氨苄西林测定结果

①质谱条件优化及离子对选择

在多反应监测模式（SRM）下优化各项质谱参数，提高其响应值（见图2）。其中定性离子对（m/z）为：350/192；定量离子对（m/z）为：350/114，350/118，350/173.5。

图2 氨苄西林标准品离子流图Fig.2 Ampicillin standard ion chromatogram

②暂养水上机检测结果

检测结果表明：40个暂养水样品中只有一个样品TWA18（鲫鱼暂养水）检出氨苄西林，浓度为0.323 ng/mL，见图3。

图3 样品TWA18色谱信息(a)chromatogram; (b)standard curveFig.3 Chromatographic information of sample TWA18

(3)暂养水中副溶血性弧菌污染情况测定

经生化及分子生物学鉴定，40个样品中有8个样品副溶血性弧菌阳性。共涉及四种水产品的8份暂养水，检出率为20%。其中：2份乌鳢暂养水检出副溶血性弧菌，占乌鳢暂养水的100%；3份鲫鱼暂养水检出副溶血性弧菌，占鲫鱼暂养水的37.5%；2份大菱鲆暂养水检出副溶血性弧菌，占大菱鲆暂养水的25%；1份鳜鱼暂养水检出副溶血性弧菌，占鳜鱼暂养水的25%。

3.讨论

从暂养水重金属与抗生素本底调查来看：首先，铅、镉、汞、砷含量符合《GB 11607—1989渔业水质标准》[7]中的规定。钠含量偏高则是由于商户会向暂养水中施加海水晶以起到净水保活的目的，但钠含量过高（本研究中最高是饮用水标准的6.12倍）对鱼体本身有多大影响，以及对鱼体内微生物种群结构的影响，进而是否会影响到抗性基因的转移传播，值得进一步进行研究；其次，暂养水中硼含量略高于饮用水中限量值，可能是有商户向暂养水中添加硼砂以起到杀菌、清洁的作用[8]，中国《食品卫生法》[9]和《食品添加剂卫生管理办法》[10]，明令禁止将硼砂作为食品添加剂使用，然而渔业水质国标中没有做相关规定，这给了一些商贩钻法律漏洞的可乘之机，而且此国标距今已30年整，有一定修订的必要；最后，氨苄西林检测结果中有一个样品检出氨苄西林说明人用抗生素有向水产养殖行业转移的趋势，但目前还不是普遍现象。封永辉等[11]对渔用药物使用中的乱象做了调研，也发现有的渔药或兽药企业直接将人用抗生素作为新品渔药使用的现象。而如果水产养殖行业长期使用人用抗生素进而导致进化出超级耐药细菌并通过某种途径感染人类，会对人类健康造成非常大的威胁[11]。