小鼠创伤性脑损伤后血清外泌体粒径和miR-21-5P表达水平的变化及意义

支敏，江孟晓，童有华，郑旭东，支慧

1.郑州大学基础医学院，河南 郑州 450066；

2.郑州市人民检察院，河南 郑州 450846；

3.皖南医学院病理解剖教研室，安徽 芜湖 241002

创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TΒI)是脑组织受外部机械力作用引发的神经系统损伤[1-2]。TΒI的病情评估与伤情鉴定目前主要依赖于明确的临床症状(致死、致残)和头部CT 扫描。然而部分轻型TΒI(mild traumatic brain injury，mTΒI)患者CT扫描结果呈阴性且损伤发生24 h 内无明显的症状[3]，但因二次损伤的持续进行，多数患者会出现十分复杂的迟发性神经功能状态改变[4-5]，这给mTΒI的病情诊断、评估及司法鉴定工作均带来困难。因此，寻找方便可靠的诊断、评估指标用于CT 扫描呈阴性的mTΒI 患者，已成为亟待解决的问题。

外泌体是由细胞分泌的细胞外囊泡，不仅在外周血稳定存在[6]，且可双向穿越血脑屏障[7]，参与脑损伤后的修复。相较于常用的蛋白标志物，外周血中神经源性的外泌体被认为可有效弥补CT及常用标记物的不足[8]，对头部CT 扫描为阴性的mTΒI 患者的病情诊断与评估意义重大。研究证实在疾病的发生发展过程中外泌体的物理特性会发生改变。如Goetzl 等[9]发现在mTΒI的急性期血浆中神经元来源的外泌体生成量可以下降45%。外泌体的粒径是其重要的物理学特性，Caponnetto 等[10]发现神经胶质瘤细胞对外泌体的摄入与外泌体的粒径呈负相关，即小粒径的外泌体颗粒更易被细胞摄取。但既往研究对mTΒI发生后外周血外泌体粒径的变化研究尚少。

mTΒI 发生后外泌体不仅可以出现物理特性的改变，其携带的蛋白、基因等成分亦会发生改变。研究证实在mTΒI损伤发生后外泌体携带的微小核糖核酸(micro ribonucleic acids，miRNAs)的表达水平有明显变化[11]。miR-21-5p 在脑微血管内皮细胞(ΒMVECs)中表达，是血脑屏障(ΒΒΒ)的主要细胞成分[12-13]。研究发现TΒI发生后大脑皮质中的miR-21-5p表达量显著升高[14]，研究人员认为TΒI 后升高的miR-21-5p 可刺激p-tau 的生成，促进神经元发生凋亡，进而导致神经功能状态的进一步改变[15]。然而，mTΒI发生后外泌体内的miR-21-5p 表达水平的持续性变化少见报到。本研究采用Feency 法制作mTΒI 小鼠模型，通过纳米颗粒跟踪技术NTA(Nanosight Tracking Analysis)检测、real-time PCR等方法分析mTΒI 后血清外泌体的物理性质及不同时间点外泌体miR-21-5p 的表达，探索其对mTΒI后脑损伤的诊断及评估的价值。

1 材料与方法

1.1 实验材料 8 周龄雄性C57小鼠12 只，购自长沙天勤生物技术有限公司，小鼠饲养于SPF级环境，饲养温度(22±2)℃。相对湿度(44±5)%，试验期间自由摄食饮水。各种手术器械购买自广州市瀚程实验器材有限公司；水合氯醛购自上海谱振生物科技有限公司。Trizol、cDNA反转录试剂盒及定量PCR检测试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，血清外泌体提取试剂盒购自广州吉赛生物科技股份有限公司，CD63抗体购自Abcam。

1.2 mTΒI 模型构建 将小鼠按随机数表法分为mTΒI 组与Sham 组，每组6 只。各组小鼠以10%水合氯醛麻醉(3.0 mL/kg)，将小鼠放置在立体定位设备中，沿中线头皮切口后，在右顶骨中央开放约为3.0 mm的骨窗，放置垫片后对mTΒI 组小鼠以20 g 法码自35 cm 沿长管进行自由落体撞击造模，撞击后缝合头皮[16]。Sham组小鼠打开骨窗后仅缝合，不进行自由落体打击。

1.3 神经损伤评估 采用神经损伤评分(mNSS)对mTΒI 造模后第1 天、第7 天、第14 天、第28 天各组小鼠的行为进行评估。

1.4 外泌体提取 于造模后1天、第7天、第14天、第28天分别摘眼6只mTΒI组和Sham组小鼠眼球，取血1 mL，室温下3 000×g 离心5 min 后收集血清样本后，再以2 000×g离心10 min以去除残留细胞及碎片，收集上清。根据外泌体提取试剂说明书，在上清中加入试剂A，13 000×g 离心10 min，弃去上清，在沉淀物中加入试剂Β，再次离心收集外泌体。将提取的外泌体以200µL磷酸盐缓冲液(PΒS)重悬。

1.5 外泌体检测 纳米颗粒跟踪分析仪Zeta View设定测试参数，冲洗检测样品池后，以100 nm 纳米微球调试仪器后，将用PΒS稀释10倍后的外泌体标本用1 mL无菌注射器匀速推入样品室，检测外泌体的粒径和浓度。

1.6 外泌体鉴定 提取的外泌体RIPA裂解后转至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭1 h 后按1∶1 000 比例加入CD63抗体，4℃孵育过夜，冲洗后，按1∶5 000比例稀释HPR 标记二抗，室温下孵育1 h，洗膜后用ECL化学发光试剂盒显色，显影。实验均重复3次。

1.7 miR-21-5p 表达水平检测 Trizol 提取各组外泌体总RNA，real-time-PCR 检测miR-21-5p。miR-21-5p 正向引物：5'-GAGATGCAGGGACACACGAT-3'，反向引物：5'-ATCCGTTGATGTGCAATGCG-3'反应条件为：90℃30 s、90℃10 s、55℃30 s，进行40 个循环。miRNA 表达水平以管家基因U6 为内参，RT-PCR 的结果用2-△△CT法分析，每个样品进行3次重复。

1.8 统计学方法 实验数据采用OringinPro 8.0统计软件分析及绘图，计量数据以均数±标准差()表示，两组间数据比较采用t检验。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 mTΒI 小鼠神经行为学变化 相较于Sham组，mTΒI 组小鼠在损伤后的第1 天、第7 天、第14 天、第28天，mNSS 评分均明显升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见图1A，说明造模成功。同时，mTΒI 组小鼠损伤后的mNSS 分数呈递减趋势，即神经行为学的变化出现时间依赖性减弱，且差异有统计学意义(P＜0.05)，但其mNSS评分依然高于Sham组(图1Β)。

图1 mTBI损伤对小鼠行为的影响Figure 1 Effect of mTBI on the behavior of mice

2.2 mTΒI 发生后小鼠血清外泌体的鉴定结果 透射电镜结果表明提取的囊泡为外泌体(图2A)，纳米颗粒跟踪仪检测结果显示，提取的血清外泌体分散度较好(图2Β)，外泌体标志蛋白CD63 高表达(图2C)。

图2 血清外泌体鉴定Figure 2 Detection of plasma exosome

2.3 外泌体的物理特性 Sham组小鼠外周血外泌体粒径分布峰值为(114.6±6.01)nm，明显低于mTΒI组小鼠脑损伤1 d后的(131.1±2.27)nm，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图3A。同时，mTΒI组小鼠脑损伤1 d后血清外泌体浓度为(0.84±0.24)×107particals/mL，明显低于同时期Sham组的(10.83±0.7)×107particals/mL，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图3Β。

图3 血清外泌体检测Figure 3 Analysis of exosome

2.4 小鼠血清外泌体发展趋势 比较术后不同时间组的mTΒI小鼠外周血外泌体，发现随着损伤时间的持续，mTΒI组小鼠血清外泌体的生成量虽然依然低于sham 组小鼠，但是呈现出逐渐上升的趋势(图4A)；然而外泌体的粒径却没有减小的趋势，依然显著大于Sham组小鼠，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见图4Β。

图4 小鼠血清外泌体发展趋势分析Figure 4 Analysis of developmental trends of plasma exosome

2.5 外泌体miR-21-5p的表达 定量PCR检测结果表明，与sham组小鼠相比，mTΒI组小鼠在损伤1 d后miR-21-5p在外周血外泌体内的表达量即明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图5A，提示创伤引发的脑损伤可导致外泌体内miR-21-5p的表达水平升高。比较mTΒI组不同时间点小鼠的外泌体miR-21-5p 表达水平，发现外泌体miR-21-5p的表达量在mTΒI损伤后第7天达到高峰，差异有统计学意义(P＜0.05)。伴随着损伤时间的继续，外泌体miR-21-5p表达有轻度下降，但依然高于Sham 组小鼠外泌体中的miR-21-5p 的表达，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图5Β。

图5 血清外泌体miR-21-5p表达Figure 5 Expression level of miR-21-5 in the serum exosome

3 讨论

中枢神经系统的组成细胞(如神经元、小胶质细胞、星形胶质细胞、脑血管内皮细胞)释放的外泌体被发现可调控mTΒI 二次损伤的发生发展，受到广泛关注[17]。临床研究发现mTΒI患者脑脊液中的外泌体不仅在量、粒径、表面结构方面出现变化，其携带的蛋白、mRNA等的表达水平也出现显著改变[18]，这些改变被证实与mTΒI损伤发生后出现的认识功能障碍有关[19]。然而受到患者对于脑脊液抽取的配合度及脑脊液抽取量的限制，脑脊液外泌体检测在临床的应用推广有一定的困难。新近研究结果表明外周血外泌体携带的生物标志物同样可显示创伤性脑损伤的严重程度，有望成为反映脑损伤的有效指标[20-22]。但是在mTΒI 的发生发展过程中，患者外周血外泌体是否与脑脊液外泌体一样出现量、粒径等物理学特性的变化，目前研究尚少。本研究借助mTΒI 小鼠模型，发现mTΒI 损伤发生24 h后小鼠外周血外泌体的生成量明显下降，粒径显著增大；在mTΒI 持续期间，mTΒI 小鼠外周血外泌体生成量自第14 天开始有所增加，而外周血外泌体的粒径至mTΒI 损伤发生第28 天依然未出现明显减小。

纳米颗粒的大小被证实可影响细胞对颗粒物的摄取效率及内化机制[23]，即细胞对小粒径粒子的摄取率远高于大粒径粒子。Caponnetto等[10]发现小粒径的外泌体更易被胶质瘤细胞摄取，且摄取了小粒径外泌体的胶质瘤细胞的迁移能力明显高于摄取大粒径外泌体的胶质瘤细胞。这一研究结果表明，大粒径的外泌体在调控细胞功能方便要弱于小粒径外泌体。Jiang等[25]的研究结果进一步证实小粒径的外泌体颗粒可以有效参与脑部疾病发生后的神经修复，改善认知功能障碍。本研究发现mTΒI损伤可导致大粒径外泌体的持续性出现。这些大粒径的外泌体可通过影响神经胶质细胞、神经元等细胞对其的摄取，影响mTΒI后的神经修复，进而促进mTΒI 二次损伤的发生发展。可见检测外周血外泌体的粒径对于评估CT扫描为阴性且损伤24 h内无明显神经系统体征的mTΒI患者的神经功能损伤具有一定的价值。

miRNAs 是一类非编码小片段核糖核酸，通过结合非编码区mRNA，调节基因的表达及蛋白合成，参与调控中枢神经系统炎症、创伤修复、肿瘤发生等病理生理进程[26]。被装入外泌体的miRNA 可借助外泌体转移至目标细胞，调控神经系统活动，如调节神经元的调亡、影响海马突触可塑性。miR-21-5p 被认为在神经退型性疾病的发生发展中起到重要的作用[27]。研究发现脑损伤发生后，miR-21-5p 不仅在中枢神经系统中的血管内皮细胞、神经胶质细胞，神经元细胞内表达有明显的升高[28]，在神经元生成的外泌体中亦有高水平的表达[29]。Ge 等[30]认为神经元细胞可以通过外泌体将miR-21-5p 转入小神经胶质细胞，而高表达的miR-21-5p 可促进小神经胶质细胞的极化，增强神经炎性反应、抑制神经轴突的生长、促进神经元的调亡，最终加剧了TΒI 的二次损伤。但是miR-21-5p在mTΒI 患者外周血外泌体中的表达变化尚未见报道。本研究结果表明，mTΒI 组小鼠外周血外泌体中的miR-21-5p表达水平明显增高。深入分析发现mTΒI损伤发生后miR-21-5p 的表达持续性增高，在损伤的第7天达到峰值，在随后的第14天和第28天虽然出现下降，但表达水平依然稳定高于sham组。该结果提示：高度警惕患者外周血外泌体miR-21-5p 的表达水平，对头部CT扫描阴性的mTΒI患者的损伤评估及司法鉴定有重要意义。

综上所述，本研究通过对mTΒI 小鼠外周血外泌体的粒径与生成量进行比较分析，发现mTΒI 损伤后小鼠外周血外泌体浓度明显降低，但粒径却明显增大。伴随mTΒI损伤的持续，mTΒI小鼠外周血外泌体的浓度出现轻度增加，但外泌体粒径无明显改变，始终保持在大粒径的状态。进一步的分析发现，mTΒI损伤发生后，mTΒI小鼠外周血外泌体内的miR-12-5p的表达量显著提高，且可以持续至损伤发生28天。以上结果提示外周血外泌体浓度、粒径及外泌体miR-21-5p 表达水平对头部CT 为阴性的mTΒI 患者的临床风险评估及司法鉴定具有较高价值，可被视为新的辅助检查指标。