热处理工艺对燕窝消化特性的影响

柳训才，赵婷，陈茂深，范群艳，邓奉红，郭宝忠，钟芳*

（1.厦门市燕之屋丝浓食品有限公司 燕窝研究院，福建 厦门 361100；2.江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122；3.北大医学-燕之屋燕窝营养与健康协同创新联合实验室，福建 厦门 361100）

燕窝，又名可食用燕窝（Edible bird's nest or Swiftlet's nest），是指特定的金丝燕（雨燕目Apodiformes雨燕科Apodidiae）的颌下腺分泌物与燕羽、草等混合构建的可食用生物制品[1,2]。其中，侏金丝燕属（C o l l o c a l i a）、金丝燕属（Aerodramus）和雨燕属（Apus）中的十多种燕类可筑造燕窝[3]。燕窝在亚洲，特别是中国被广泛食用，被视为滋补佳品。中医典籍曾描述燕窝具有“益气化痰、滋肾养肺、补脾和胃、调补虚劳”的功效[4,5]。其次，现代科学研究表明，燕窝在美白、抗病毒、免疫调节、增强智力和记忆力、改善神经退行性疾病和抗氧化等多个领域都被发现具有独特的功效[1-2, 6-9]。这些记载和研究都证实了燕窝的滋补价值。此外，由于燕窝的珍稀特点，燕窝从古至今都被赋予了很高的地位，被视为是对品质的追求和对生活的高标准要求，特别是燕窝常出现在中国古代的诗文、典籍和皇家食谱中[4,10]。

随着燕窝产业的发展，消费者愈发倾向于消费即食燕窝产品。即食燕窝产品属于一种方便食品，可以即开即食。其中，燕窝挑拣、炖煮、包装等工序均由工厂在标准流程下完成，给予了消费者方便的同时，使得即食燕窝产品品质得到有效控制。现在，消费者对即食燕窝产品的期望除了满足安全、美味以外，还要满足其对营养价值的需求。燕窝中的主要营养成分是蛋白质与唾液酸，且燕窝原料中的唾液酸大部分以与蛋白结合的形态存在，已有研究证明不同形态的唾液酸在机体吸收利用方面存在差异[11,12]。特别是热处理可能通过影响蛋白变性程度进而影响燕窝中唾液酸糖蛋白的消化情况，以及最终消化产物中蛋白质与唾液酸的溶出情况。

因此，炖煮是对燕窝营养价值产生影响的重要因素，特别是在标准流程的即食燕窝生产过程中，然而炖煮工艺中的热处理强度对燕窝主要功效成分消化特性的影响还未被科学研究。基于此，本研究对100、110、115、120 ℃分别炖煮处理30 min后的燕窝进行体外模拟消化，旨在明确燕窝热处理工艺（强度）对燕窝蛋白质、唾液酸模拟消化特性的影响，以优化燕窝的科学炖煮工艺，进一步提升燕窝的利用效率和应用价值。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

紫外可见分光光度计：UV-2802，上海尤尼柯仪器有限公司；电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；集热式恒温加热磁力搅拌器：DF-101S，巩义市俞华仪器有限公司；电热鼓风干燥箱：DHG-9003，上海一恒科学仪器有限公司；数显温控消化炉：KDN-08C，上海新嘉电子有限公司；凯氏定氮仪：KDN-103F，上海纤检有限公司；高效液相色谱仪：Waters 2695（带2475荧光检测器，2998紫外检测器），沃特世科技有限公司；化学发光凝胶成像系统：ChemiDoc XRS+，美国伯乐公司；全波长酶标仪：M2，美国分子仪器公司；高速离心机：5430，德国艾本德公司。

1.2 试剂和材料

燕窝：厦门市燕之屋丝浓食品有限公司；N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac，纯度≥98%）、0.25%胰蛋白酶溶液、磷酸盐缓冲液、胎牛血清、青霉素-链霉素双抗：上海创赛科技有限公司；胃蛋白酶、胰酶：Sigma-Aldrich有限公司；乙腈、甲醇为色谱纯；高碘酸、邻苯二胺盐酸盐、磷酸、四氢呋喃、氢氧化钠等试剂均为分析纯：中国国药集团上海化学试剂公司。

1.3 燕窝的模拟消化

根据Infogest Ⅱ体外消化模型稍作修改[13]，构建燕窝模拟胃肠道消化模型，本消化模型包括模拟胃消化和模拟肠消化2个阶段。

在胃消化阶段，将不同温度热处理的燕窝与提前配制好的8.0 mL模拟胃液（含6.9 mmol/L氯化钾，0.9 mmol/L磷酸二氢钾，25 mmol/L碳酸氢钠，47.2 mmol/L氯化钠，0.1 mmol/L氯化镁，0.5 mmol/L碳酸铵，0.15 mmol/L氯化钙和4000 U/mL胃蛋白酶）于50 mL离心管内混合，用盐酸溶液调节pH至2.0±0.2，而后补水使体系的体积达到20.0 mL，内置转子，于37 ℃恒温加热磁力搅拌器内隔水浴反应，分析0、30、60、90、120 min的消化情况。每个时间点均为独立的消化离心管，0 min时刻离心管加入预先灭活的胃蛋白酶，每隔30 min依次在相应时间的离心管中用氢氧化钠溶液调节pH至8.0灭酶，于4500 r/min离心10 min，分离上清液并于-20℃储藏。

模拟胃消化结束后，进入模拟小肠消化阶段。向其中加入提前配制好的16.0 mL模拟肠液（含6.8 mmol/L氯化钾，0.8 mmol/L磷酸二氢钾，85 mmol/L碳酸氢钠，38.4 mmol/L氯化钠，0.33 mmol/L氯化镁，10 mmol/L氯化钙，2 mg/mL胰酶，2 mg/mL胆盐），用氢氧化钠溶液调节pH值至7.0±0.2，补水使体系的体积达到40.0 mL，内置转子，于37 ℃恒温加热磁力搅拌器内隔水浴反应，将相应时间的离心管置于沸水中加热灭酶，于4500 r/min离心10 min，分离上清液并于-20℃储藏。

1.4 燕窝蛋白质消化率测定

燕窝蛋白质含量测定参照GB 5009.5—2016凯氏定氮法，蛋白质折算系数6.25。燕窝蛋白质消化率的计算如式⑴所示：

1.5 燕窝蛋白质SDS-PAGE凝胶电泳

通过SDS-PAGE凝胶电泳对燕窝蛋白质分子质量进行测定。取燕窝消化上清液和等体积的2×上样缓冲液混合，100 ℃加热3 min变性处理，10000 r/min离心3 min。电泳条件为：10%分离胶，5%浓缩胶，浓缩电压80 V，分离电压120 V，上样量15 μL。电泳结束后，将凝胶置于质量体积分数为0.1%考马斯亮蓝R-250染色液（甲醇∶乙酸∶蒸馏水为=9∶2∶9，v/v/v）中染色过夜，后续将染色后的凝胶置于脱色液（甲醇∶乙酸∶蒸馏水=1∶1∶8，v/v/v）中，至脱色完全，拍照分析结果。

1.6 燕窝蛋白质水解度测定

燕窝消化产物和原料的氨基酸态氮的测定参照中性甲醛滴定法。水解度（degree of hydrolysis，DH）计算如式⑵所示：

1.7 多肽相对分子质量分布测定

参考GB 31645—2018胶原蛋白肽的测定，测定燕碎消化产物中的多肽相对分子质量分布。

色谱条件：色谱柱：TSKgel G2000 SWXL（7.8 mm×300 mm，5 μm）；柱温：30℃；流动相：乙腈∶水∶三氟乙酸=40∶60∶0.05（v/v/v）。

检测器：紫外检测器；检测波长：220 nm；流速：0.5 mL/min；进样体积：10 μL。

1.8 不同形态唾液酸含量及总唾液酸消化率测定

唾液酸的存在形式包括游离态的唾液酸、与低聚糖结合的唾液酸、与脂类结合的唾液酸和与蛋白质结合的唾液酸，燕窝中的唾液酸主要结合在唾液酸糖蛋白糖链中的非还原末端。采用下述方法测定燕窝及其消化产物中不同形态唾液酸含量。

⑴ 总唾液酸含量及总唾液酸消化率测定

酸水解：取燕窝或其消化物粉末约50 mg，加入40.0 mL体积分数为1%磷酸溶液于沸水浴中水解20 min，取出后冷却，于5000 r/min离心10 min得上清液，待衍生。

唾液酸标准溶液配制：配制1.0 mg/mL唾液酸标准品母液，稀释成不同浓度使用液，待衍生。

衍生条件：配制20 mg/mL的邻苯二胺盐酸盐溶液，与1.0 mL样品溶液等体积混合，于80 ℃避光水浴40 min，冷却后过0.45 μm滤膜，待测。总唾液酸消化率计算如式⑶所示：

⑵ 游离态唾液酸含量测定

衍生条件：取1.0 mL待测样品，加入20 mg/mL的邻苯二胺盐酸盐溶液1.0 mL，于50 ℃避光水浴2.5 h，改变温度至4 ℃继续衍生48 h，过0.45 μm滤膜，待测。游离态唾液酸消化率计算如式⑷所示：

⑶ 聚糖态唾液酸含量测定

取1.0 mL待测样品，加入等体积的Sevage试剂（氯仿∶正丁醇=4∶1，v/v），多次萃取，直至无沉淀产生，以去除与蛋白质结合的唾液酸。取萃取的水相层，加入等体积体积分数为2%磷酸溶液，沸水浴水解20 min，测定除去唾液酸糖蛋白后的消化液中的总唾液酸含量，聚糖态唾液酸消化率计算如式⑸所示：

⑷ 蛋白态唾液酸含量测定

取1.0 mL待测样品，加入等体积体积分数为2%磷酸溶液，沸水浴水解20 min，测定溶液中总唾液酸含量，蛋白态唾液酸消化率计算如式⑹所示：

1.9 数据处理

数据结果采用SPSS 23进行统计分析，对各组之间的差异采用单因素方差分析（oneway-ANOVA），两两比较进行Tukey's检验，假设检验水准a=0.05。数据结果采用Origin Pro 8.0进行作图。

2 结果与讨论

2.1 燕窝蛋白质消化率

燕窝中的主要营养成分唾液酸糖蛋白是一种黏蛋白，吸水后溶胀但不易溶于水[14]。经120 ℃处理的燕窝消化0 min时蛋白质溶出率仅有32.47%，经高温热处理30 min后的燕窝丝仍能保持应有的均匀絮状结构，表明燕窝具有耐炖煮的加工特性。

消化过程包括120 min前的胃消化阶段和120 min后的肠消化阶段。由表1可知，燕窝蛋白质的消化主要发生在胃阶段，0～120 min间燕窝蛋白质的消化率提高了16.88%～24.13%。消化120 min时，相较于100 ℃热处理的燕窝蛋白质消化率（36.24%），115 ℃热处理后的燕窝蛋白质消化率显著提高了30.05%，120 ℃热处理后的燕窝蛋白质消化率显著提高了36.17%。如表1所示，消化时间为240 min时，115 ℃热处理的燕窝蛋白质消化率为62.71%，较100 ℃热处理的燕窝蛋白质消化率显著提高了29.94%（1.30倍）；115 ℃及120 ℃热处理的燕窝蛋白质消化率相近，无显著差异（P＞0.05）。结果表明，在研究的温度范围内，热处理温度提高更有利于蛋白质热变性，燕窝蛋白质消化率随之提升，在115 ℃及以上时达到相对稳定状态。

表1 不同热处理对燕窝消化过程中蛋白质的消化率（n=3, X±SD%）

2.2 燕窝蛋白质消化后分子质量变化

进一步利用SDS-PAGE凝胶电泳分析燕窝蛋白质消化过程中的分子质量变化。由图1可知，消化初始阶段（0 min），燕窝蛋白质存在较多条带堆积于浓缩胶顶部（分子质量＞250 ku），表明燕窝在消化初始阶段（0 min）存在较多分子质量＞250 ku的蛋白质。在消化0～120 min时，电泳条带明显下移，分布于10～250 ku范围内，说明这些燕窝大分子质量蛋白质主要在120 min前的胃消化阶段被消化、降解。消化120 min后，进入肠消化阶段时，100～250 ku处的条带几乎消失，随着消化时间的增加，条带进一步下移，此时燕窝蛋白质几乎完全被消化，转化为分子质量较低的肽或氨基酸，分子质量进一步降低。同时，这也导致部分消化物分子质量过低，10%的分离胶无法将其分离，故无法在SDS-PAGE凝胶电泳图中显示。这与冼小敏的研究结果类似[15]。

图1 消化过程中燕窝蛋白质分子质量分布

对比不同热处理强度的电泳图（0 min），120 ℃热处理的燕窝蛋白质电泳图条带整体相对100 ℃热处理的燕窝蛋白质电泳图条带颜色更深，这表明120 ℃热处理促进更多燕窝蛋白质溶出。同时，在胃消化阶段结束时（120 min），100 ℃热处理的燕窝蛋白质条带主要分布在10 ku与45 ku附近；随着热处理温度的升高，110 ℃及以上热处理的燕窝在20～25 ku处也逐渐出现蛋白质条带，表明提高热处理温度在促进燕窝蛋白质消化溶出的同时，也促进了燕窝大分子蛋白质解聚成小分子，即促进燕窝的消化。

胃消化阶段大分子质量燕窝蛋白质的降解效率更高，可能归因于胃蛋白酶的作用。胃蛋白酶属于肽链内切酶，对肽键的专一性较差，其可以将大分子燕窝蛋白质降解为多肽，但很难产生氨基酸[16]。而更高温度的热处理提高燕窝蛋白质消化率，可能是因为热处理改变了蛋白质的空间结构，有利于胃蛋白酶与蛋白质结合，提高了酶反应效率。而更高强度的热处理对燕窝蛋白质空间结构的破坏程度更大，这进一步提高了燕窝蛋白质的消化率。

2.3 燕窝蛋白质消化过程中多肽相对分子质量变化

相比于完整的大分子蛋白质，多肽更容易被人体吸收利用[17]。分析燕窝蛋白质消化后水溶性蛋白质中多肽的相对分子质量分布，进一步评价燕窝蛋白质的生物可及性，结果如表2所示。燕窝蛋白质消化产物按照相对分子质量划分为低聚肽（＜1 ku），中等分子质量肽段（1～5 ku）和大分子肽段（5～10 ku）和蛋白质（＞10 ku）。燕窝蛋白质经消化120 min后，多肽相对含量分布趋于稳定，低聚肽和蛋白质的相对百分比略有增加，中等分子质量肽和大分子肽段相对百分比减少，与消化率和SDS-PAGE凝胶电泳结果一致，表明大部分燕窝蛋白质在胃消化阶段被消化。燕窝蛋白质经消化240 min后的多肽主要以＜1 ku的低聚肽为主，这同样与SDS-PAGE凝胶电泳结果一致。

表2 消化过程中燕窝多肽相对分子质量构成百分比变化（n=1,X%）

值得注意的是，相比于100 ℃热处理的燕窝，110 ℃及以上温度热处理的燕窝在胃消化阶段（120 min）出现更多的相对分子质量＜1 ku的低聚肽，与SDSPAGE电泳结果一致，表明提高热处理温度有利于胃蛋白酶水解燕窝蛋白质，促进了燕窝中大分子蛋白质解聚成小分子蛋白质，即促进燕窝消化。

2.4 消化过程中唾液酸存在方式的变化

燕窝原料中约含9%～11%的唾液酸，其极少以游离态的形态存在。与蛋白质结合的唾液酸在燕窝制品的热加工过程中稳定性高，并不会发生唾液酸链的断裂[19]。然而，上述研究表明热处理会显著提升燕窝中的蛋白质消化性，因此进一步评估了经过不同温度热处理的燕窝中唾液酸的消化情况，消化过程中唾液酸存在形态构成分布如图2所示。结果表明，在体外消化的过程中，唾液酸不断被释放，而唾液酸的溶出主要集中在胃阶段，在肠阶段游离态唾液酸含量保持稳定，但是会发生部分蛋白态唾液酸转变为聚糖态唾液酸的变化。

图2 热处理对消化过程中不同形态唾液酸含量占比的影响

首先，在本实验中测定了经不同温度热处理燕窝的总唾液酸含量。结果表明，所有经过热处理的燕窝样品总唾液酸含量无显著性差异（P＞0.05），范围为2167～2238 mg/kg，即未见热处理对燕窝总唾液酸含量的影响。随后，计算了不同温度热处理燕窝不同形态唾液酸含量占比，结果如图2所示，随着热处理温度的升高，在240 min的消化终点时燕窝中被消化后溶出的唾液酸占比逐渐升高。特别是经过100 ℃热处理的燕窝在240 min的消化终点时共有46.22%的总唾液酸被消化后溶出，经过115 ℃热处理的燕窝在240 min的消化终点时共有86.28%的唾液酸被消化后溶出，为100 ℃热处理燕窝的187%（1.87倍）；115 ℃、120 ℃处理后的燕窝唾液酸总消化率均显著大于100 ℃热处理的燕窝的唾液酸消化率（P＜0.05），但二者之间并无显著差异（P＞0.05）。高温热处理促进燕窝在消化过程中总唾液酸溶出的同时，也促进了游离态、聚糖态唾液酸的溶出，经100 ℃热处理的燕窝在240 min体外消化后，仅产生11.67%的游离态唾液酸与10.83%的聚糖态唾液酸；而经120 ℃热处理后，这2种形态唾液酸的含量显著增大到26.58%与49.45%（P＜0.05）。上述结果表明，提高热处理温度可促进燕窝唾液酸的消化溶出。

综上，高温热处理对燕窝唾液酸消化的促进作用，可能归因于热处理促进大分子质量的唾液酸糖蛋白的消化，使其转变成分子质量更小的游离态或聚糖态唾液酸。游离态唾液酸在体内可被直接吸收，而聚糖肽唾液酸形式可能有利于避免单体唾液酸的热分解，同时唾液酸连接糖链后分子质量增大，延缓了唾液酸的排出[20]。在母乳中，占比67.6%及以上的唾液酸是以聚糖态唾液酸形式存在[21]。基于此，115 ℃及以上温度热处理的燕窝经过消化后接近50%的唾液酸以聚糖态唾液酸形式存在，更为接近母乳中唾液酸的聚糖态唾液酸含量占比。

3 结论

炖煮对燕窝的营养价值有较大影响，本研究对100、110、115、120 ℃分别炖煮处理30 min后的燕窝进行体外模拟消化，明确了燕窝热处理工艺（强度）对燕窝蛋白质、唾液酸消化特性的影响。结果表明，热处理温度的提高更有利于燕窝蛋白质的热变性，高温炖煮能显著提升燕窝的体外消化率，115 ℃炖煮燕窝的蛋白质、唾液酸消化率分别为100 ℃炖煮燕窝的1.30倍、1.87倍；115 ℃及120 ℃炖煮燕窝消化率相近。同时，热处理温度的提高使消化后的唾液酸形态分布发生改变，更多地以游离态和聚糖态唾液酸形式存在，更接近于母乳唾液酸存在形态。综上，本研究所得结果可为即食燕窝炖煮工艺的优化提供指导，有助于燕窝的利用效率和应用价值的进一步提升。