miR-29c-3p/IGF1 分子轴对肝星状细胞活化，增殖和凋亡的作用机制

张 梁 ，王保全 ，雷喜锋 ，王 旭 ，柯 阳 ，张 玮

（1）渭南市中心医院普外科，陕西 渭南 714000;2）昆明医科大学第二附属医院肝胆胰外科，云南 昆明 650101）

过量饮酒会促进酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD），如脂肪变性、脂肪性肝炎、纤维化到肝硬化，最终导致肝细胞癌，这是所有慢性肝病的主要死亡原因[1-2]。在ALD 的发展进程中，肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）扮演者重要的角色。HSCs 是慢性肝损伤创面愈合相关纤维化过程的主要参与者之一[3-4]。在健康器官中，它们是非实质细胞群的一部分，占据肝细胞和窦状内皮细胞之间的间隙[5]。在组织损伤、炎症和伴随的可溶性介质（例如TGF-β）激活后，HSCs转分化为肌成纤维细胞样细胞，表现出增殖、收缩和成纤维特性，成为纤维化肝脏中纤维性胶原的主要来源[4，6]。HSCs 还参与邻近细胞的复杂交互，以促进肝纤维化进展。因此，阐明HSCs的分子调控机制对ALD 的治疗具有重要的意义。

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一种由18～24 个核苷酸的组成的非编码RNA，通常情况下，miRNA 在细胞质RNA 诱导沉默复合体中与靶mRNA 的3'-UTR 相互作用以抑制mRNA 翻译和诱导降解它[7-8]。具体来说，一些miRNA，如miR-122 和miR-21 已被证明在ALD 的肝纤维化的发展中发挥作用，调节包括组织炎症、细胞凋亡和HSCs 的激活等过程[9-10]。此外，由于miRNA 释放到血液中的疾病依赖性以及它们在血清中的相对稳定性，miRNA 是检测ALD 严重程度和致癌性的潜在非侵袭性生物标志物[11]。近期，Zhang 等[12]通过生物信息学分析发现，miR-29c-3p 在ALD 模型小鼠肝脏的表达水平显著低于正常小鼠，且预测其为ALD 治疗的潜在靶标。然而，目前还没有文献报道，miR-29c-3p 对ALD 中HSCs 活化，增殖和凋亡的调控机制。

综上所述，本研究拟探讨miR-29c-3p 在静息和活化HSCs 中的表达差异，并且检测其对HSCs 活化，增殖和凋亡的影响，此外，笔者还拟通过生物信息学方法预测miR-29c-3p 的下游靶标，并验证miR-29c-3p 是否通过该靶标参与HSCs 生物学行为的调控。

1 材料与方法

1.1 小鼠HSCs 的原代培养和鉴定

从C57BL/6 J 小鼠（24.0～26.0 g，8～10 周龄）中分离HSCs。简而言之，C57BL/6 J 小鼠原位灌注四乙酸和胶原酶获得全肝细胞悬液，用Percoll密度梯度离心法获得HSCs。将细胞调整到3×106细胞/mL，接种在25 cm2的培养瓶中，其中含有包含10%胎牛血清的5mL DMEM 完全培养基和1%青霉素/链霉素。采用TGF-β 活化HSCs后，采用免疫荧光检测HSCs 活化标志物ɑ-SMA的表达。简而言之，HSCs 与一抗抗ɑ-SMA（1∶250）在4℃下孵育过夜，随后用二抗染色。在400 倍放大的荧光显微镜下测量细胞ɑ-SMA荧光阳性表达的变化并收集图像。

1.2 细胞分组及转染

首先，为观察miR-29c-3p 对HSCs 的影响，将细胞分为NC 组（未转染）、NCmimic 组（转染miRNAmimic 阴性对照）和miR-29c-3pmimic 组（转染miR-29c-3pmimic）。为进一步观察miR-494-3p 和IGF-1 对HSCs 的影响，将细胞分为NC 组（未转染）、sh-NC 组（转染sh-NC 阴性对照）、sh-IGF-1 组（转染sh-IGF-1）和sh-IGF-1+miR-29c-3pinhibitor 组（同时转染sh-IGF-1 和miR-29c-3pinhibitor）。miR-29c-3pmimic/inhibitor和sh-IGF-1，及它们对应的阴性对照购买于广州锐博生物技术有限公司。将HSCs 接种于6 孔板（5×104细胞/mL），按照说明书使用Lipofectamine 2000 试剂及分组信息，进行50 nM miR-29c-3p mimic/inhibitor/NCmimic/sh-IGF-1/sh-NC 的转染。转染48 h 后，采用RT-qPCR 和WB 检测转染效率。

1.3 实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerasechain reaction，RTqPCR）

使用TRIzol Regent 按照说明书提取HSCs 的总RNA 样本，然后用TurboDNase 试剂盒去除DNA。用NanoDrop 对提取的总RNA 进行定量。用带用gDNA Eraser 的PrimeScriptTM RT 试剂盒逆转录将2 µg 总RNA 逆转录为cDNA。采用SYBR Green PCR Master Mix 在Bio-Rad Real-Time PCR 仪上进行qPCR 检测miR-29c-3p 的表达。采用U6 作为内部参考。每个数据重复3 次，用2-ΔΔCt 法计算miR-29c-3p 的相对表达水平。本研究使用的引物如下：miR-29c-3p sense：5’-GCTGACCGATTTCTCCTGGT-3’ ；miR-29c-3p antisense：5’-TCCCCCTACATCATAACCGA-3’；U6 sense：5’-CTAGATAATGGTGCTGATAGATGGA-3’；U6 antisense：5’-GGCACACCAGAAATCGAAGC-3’。

1.4 免疫印迹实验（western blot，WB）

使用RIPA 裂解缓冲液从HSCs 中提取总蛋白，使用BCA 蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，将60 µg 总蛋白质样本进行分离后，转移到硝化纤维素膜上。用5%脱脂牛奶进行阻断，在4℃下用小鼠单克隆抗ɑ-SMA（1∶1 000），DDR2（1∶2 000），FN1（1∶1 000），ITGB1（1∶2 000）和GFAP（1∶1 000）孵育过夜。用TBST 清洗膜，然后与适当的辣根过氧化物酶结合的二抗孵育。采用增强型化学发光试剂进行膜的显影，并使用Image Lab™软件捕获信号并定量条带灰度值。

1.5 双荧光素酶报告基因实验

采用Starbase 数据库预测IGF-1 和miR-29c-3p 的3’ UTR 结合序列。用PCR 分别扩增野生型和突变型IGF-1 与miR-29c-3p 的3’ UTR 结合序列，将片段装入pMIR-REPORT luciferase microRNA expression reporter vector。参照Lipofectamine 2000试剂盒说明书，将0.1 µg 野生型和突变型的IGF-1 荧光素酶报告载体分别共转染到带有miR-29c-3pmimic 的HEK-293 细胞中。转染48 h 时后，收集细胞裂解液，根据制造商的说明书，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测量各组的荧光素酶活性。

1.6 CCK-8 实验

采用CCK-8 试剂盒检测HSCs 的细胞活力。简而言之，将5×104细胞/mL 的各组HSCs 加入96 孔板中孵育24 h。各组HSCs 转染24、48 和72 h 后，分别在各孔加入CCK8 溶液。2 h 后，使用酶标仪测量450 nm 处的吸光度。

1.7 克隆形成实验

各组HSCs（5×102细胞/mL）接种到含有37℃预热培养基的6 孔板中，置于37℃培养箱中培养。每2 d 更换一次培养基，放置14 d。随后，各组HSCs 用1∶3 乙酸/甲醇固定30 min，用Giemsa染色20 min，肉眼计数细胞克隆数。

1.8 流式细胞术

采用Annexin V-FITC/PI 试剂盒检测HSCs 凋亡情况。取1×Annexin V 结合液500 µL 制备终浓度为1×106细胞/mL 的HSC 悬液，加入6 孔板上。在细胞悬液中加入5 µL Annexin V-FITC 和5 µL 丙二碘，室温暗培养15 min。流式细胞术检测细胞凋亡情况。坏死细胞位于左上区（AnnexinV-，PI+），晚期凋亡细胞位于右上区（AnnexinV+，PI+），活细胞位于左下区（AnnexinV-，PI-），早期凋亡细胞位于右上区（AnnexinV+，PI-）。

1.9 统计学处理

所有数据重复3 次独立实验，数据以均数±标准差表示，并通过SPSS 22.0 软件进行统计分析。根据数据组成，2 组间比较使用student’st检验，多组间比较采用单因素方差分析（两两比较采用LSD 法），P＜ 0.05 为有统计学意义。

2 结果

2.1 HSCs 的分离及miR-29c-3p 表达差异

如图1A 所示，ɑ-SMA 阳性表达表明成功从小鼠中分离出HSCs。TGF-β 处理细胞后，HSCs 活化相关蛋白ɑ-SMA，DDR2，FN1 和ITGB1 表达水平明显增加，而GFAP 的表达水平则反之（P＜ 0.01，图1B）。值得注意地，miR-29c-3p 在激活的HSCs 中呈现低表达（P＜ 0.01，图1C）。以上结果表明，HSCs 被成功分离并激活，且miR-29c-3p 在不同状态的HSCs 中异常表达。

图1 成功分离HSCs，并且miR-29c-3p 在不同状态的HSCs 中差异表达Fig.1 Successful isolation of HSCs and differential expression of miR-29c-3p in HSCs of different status.

2.2 miR-29c-3p 对HSCs 活化，增殖和凋亡的影响

由于miR-29c-3p 在HSCs 中的异常状态，进一步探讨了miR-29c-3p 对HSCs 活化，增殖和凋亡的影响。首先，通过miRNAmimic 外源性的调控了活化的HSCs 中miR-29c-3p 的表达。转染效率结果表明，miR-29c-3p mimic 可以增加活化的HSCs 中miR-29c-3p 的表达水平（P＜ 0.001，图2A）。WB 结果表明，过表达miR-29c-3p 能够减低活化相关蛋白ɑ-SMA，DDR2，FN1 和ITGB1 表达水平，并增加GFAP 的表达（P＜ 0.01，图2B）。相较于NCmimic 组，miR-29c-3pmimic组中活化HSCs 的增殖活力（P＜ 0.01，图2C）和克隆形成数（P＜ 0.01，图2D）均有降低，并且凋亡比例增加（P＜ 0.01，图2E）。以上结果表明，miR-29c-3p 能够抑制HSCs 的活化和增殖，并促进其凋亡。

图2 miR-29c-3p 抑制HSCs 的活化和增殖，并促进其凋亡Fig.2 miR-29c-3p inhibits the activation and proliferation of HSCs and promotes their apoptosis.

2.3 miR-29c-3p 下游靶标预测及验证

调控下游mRNA 的表达是miRNA 在生物学进程中的主要功能之一。因此，笔者通过Starbase 数据库预测了miR-29c-3p 的下游可能靶标。如图3A 所示，IGF-1 可能是miR-29c-3p 的下游靶标，并且通过双荧光素酶报告基因检测发现，miR-29c-3p mimic 能够抑制细胞内野生型IGF-1 的荧光素酶活性（P＜ 0.01），但是对突变型IGF-1 的荧光素酶活性无影响（P＞ 0.01）。进一步，通过WB 检测了miR-29c-3p 对活化HSCs 中IGF-1 表达的影响。结果显示，过表达miR-29c-3p 可抑制IGF-1 的表达（P＜ 0.01，图3B），低表达miR-29c-3p 能促进活化HSCs 中IGF-1 表达（P＜0.01，图3B）。以上结果表明，在HSCs 中，IGF-1 是miR-29c-3p 的下游靶标。

图3 IGF-1 是miR-29c-3p 下游靶标mRNAFig.3 IGF-1 is a downstream target mRNA of miR-29c-3p.

2.4 miR-29c-3p 通过IGF1 对HSCs 活化，增殖和凋亡的影响

进一步探讨了miR-29c-3p 是否是通过IGF1对HSCs 活化，增殖和凋亡产生影响的。结果表明，活化的HSCs 中转染miR-29c-3pinhibitor 或sh-IGF-1 能够降低miR-29c-3p 或IGF-1 的表达水平（P＜ 0.05，图4A、图4B）。回复实验表明，相较于sh-NC 组，sh-IGF-1 组中活化相关蛋白ɑ-SMA，DDR2，FN1 和ITGB1 表达水平降低，并且GFAP 的表达增加（P＜ 0.05，图4C）；相较于sh-IGF-1 组，sh-IGF-1+miR-29c-3pinhibitor组中活化相关蛋白ɑ-SMA，DDR2，FN1 和ITGB1表达水平增加，并且GFAP 的表达减少（P＜ 0.05，图4C）。此外，敲低IGF-1 的表达能够降低活化HSCs 的增殖活力（P＜ 0.01，图4D）和克隆形成数（P＜ 0.01，图4E），并且增加其凋亡水平（P＜0.001，图4F），但是在此基础上同时敲低miR-29c-3p 的表达则会逆转这一过程。以上结果表明，IGF-1 能够促进HSCs 的活化和增殖，并抑制其凋亡，这一功能被miR-29c-3p 靶向抑制。

图4 miR-29c-3p 通过IGF-1 抑制HSCs 的活化和增殖，并促进其凋亡Fig.4 miR-29c-3p inhibits the activation and proliferation of HSCs and promotes their apoptosis through IGF-1.

3 讨论

非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）及其晚期形式-非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）已成为一种代谢性流行病[2]。此前的生物信息学分析表明，miR-29c-3p 在ALD 患者血液中的表达水平显著低于正常人群[12]，但是其功能还没有在ALD 中得到验证。在本研究中，笔者成功分离了小鼠中的HSCs，并且发现激活的HSCs 中miR-29c-3p 异常低表达。此外，笔者还发现，过表达miR-29c-3p 能够抑制HSCs 的激活和增殖，并促进其凋亡。值得注意地，miR-29c-3p 的这一功能是通过靶向调控IGF-1 的表达实现的。这些结果证实了Yao 等[12]的预测，并为miR-29c-3p作为ALD 的治疗靶标提供了理论基础。

HSCs 活化是ALD 进程中肝纤维化的关键事件，也是肝脏细胞外基质的主要来源之一，它们已被确定为主要负责肝脏纤维化发展的前体细胞类型[13]。肝损伤后，HSC 经历活化，导致典型的星形，脂肪储存表型的丧失和肌成纤维母细胞样表型的获得[13-14]。因此，为了缓解ALD 的发展进程，如何抑制HSCs 的活化成为了主要目标之一。研究表明，ɑ-SMA，DDR2，FN1，ITGB1和GFAP 已成为研究做多的HSCs 活化标志物[15-16]。在笔者的研究中发现miR-29c-3pmimic 可以抑制ɑ-SMA，DDR2，FN1 和ITGB1，并促进HSCs中GFAP 的表达。这表明，过表达miR-29c-3p可以抑制HSCs 的活化，这对缓解ALD 的肝纤维化至关重要。此外，介导HSCs 增殖和凋亡对明晰ALD 的机制也是十分重要的。例如，Liang 等[17]表明，嘌呤信号通路调节HSCs 激活和增殖，这在ALD 中起着关键作用。研究表明，miRNA-150-5p 抑制HSCs 增殖，并在肝纤维化期间使HSCs凋亡敏感，这有利于缓解ALD 的肝纤维化进程[18]。本研究表明：miR-29c-3p 的过表达对HSCs 的增殖是有抑制作用的，并且促进HSCs 的凋亡。此外，Chen 等[19]表明，miR-29c-3p 通过激活ADH6 增强子促进酒精脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADHs）基因簇表达，而ADHs 在酒精代谢和酒精毒性中起着至关重要的作用，这或许是miR-29c-3p 调控HSCs 参与ALD 的机制之一。

众所周知，miRNAs 通过介导下游靶标mRNA 的表达是参与调控多种生物学进程的主要途径之一[20-21]。在本研究中，通过Starbase 数据库预测发现IGF-1 是miR-29c-3p 的下游靶标之一，并通过双荧光素酶报告基因实验进行了验证。IGF-1 是一种70-氨基酸合成代谢激素，具有多种内分泌，旁分泌和自分泌作用[22]。胰岛素样生长因子-1（Insulin-like growth factor-1,IGF-1）和IGF 结合蛋白（IGF-binding proteins,IGFBPs）在包括肝脏在内的多种组织中产生，主要是对生长激素（growth hormone,GH）信号的反应。肝脏合成的IGF-1 和 IGFBPs 占全身循环 IGF-1 和 IGFBPs 的大部分[23]。众所周知，IGF-1 主要由肝脏产生（占循环IGF-1 的75%），但几乎每个组织都能够分泌IGF-1 用于自分泌/旁分泌的目的[22-23]。此前的研究表明，IGF-1 是非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）/非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）治疗的生物学靶标，IGF-I 可以调控细胞衰老和激活，从而介导NASH 中的肝纤维化[24-26]。IGF-I 治疗已被证明可以改善NASH 和肝硬化的动物模型[27-28]，表明IGF-I 在这些条件下的潜在临床应用。在ALD 中，有研究表明，S-烯丙基巯半胱氨酸通过直接调节IGF-I 信号通路来改善ALD[29]。Mølle 等[30]表明，IGF-I 是ALD 患者的生存独立预测因子。本研究中，HSCs 中转染sh-IGF-1 能够降低细胞活化和增殖，并上调其凋亡比例。但是，这一过程受miR-29c-3p 的调控。

综上所述，笔者证明了miR-29c-3p 能够通过靶向下调IGF-1 的表达水平，进而抑制HSCs活化和增殖，并促进其凋亡。本研究为AH 提供了新的治疗策略。但是，本研究仅仅只在HSCs验证了miR-29c-3p 的功能，体内实验验证miR-29c-3p 在ALD 中的功能仍需进一步的挖掘。