大鼠伏核甘丙肽镇痛作用及其机制

彭煜航，李焱娟，曲婧红，唐代欢，张宏伟，吴 睿，徐世莲

（昆明医科大学基础医学院生理学系，云南 昆明 650500）

神经病理性疼痛和炎症痛是临床常见的疼痛，但至今临床镇痛药物疗效并不理想，且具有明显的药物副作用，故寻找和开发新的镇痛效果强而毒副作用小的镇痛药物具有重要意义。

甘丙肽是一种广泛分布于哺乳动物中枢神经系统和外周的重要的神经肽[1]。研究报道甘丙肽可抑制炎症介质引起的机械超敏反应[2]；对糖尿病外周神经痛具有镇痛作用[3]；在三叉神经损伤后的神经痛和神经再生中也有重要作用[4]。本实验通过大鼠足底皮下注射鹿角菜碱制作炎症痛动物模型和左侧坐骨神经结扎制作神经痛动物模型，研究甘丙肽对不同动物模型的镇痛作用。

随着甘丙肽受体激动剂和拮抗剂的开发和应用，越来越多的研究报道甘丙肽对痛觉的调节作用可能是通过激活其受体来完成的[5-7]。甘丙肽有3 种受体，分别是甘丙肽受体1-3（galanin receptor 1-3，GalR1-3）[8]。本实验通过比较甘丙肽对正常大鼠、炎症痛大鼠和神经痛大鼠不同动物模型的镇痛作用；并检测不同模型大鼠GalRs的表达，探索甘丙肽对痛觉信息的调节作用是否通过甘丙肽受体的激活来完成。

伏核可分为核与壳两部分，每侧大脑半球各有一个。早在1999 年，Gear 等[9]研究报道伏核是一个参与痛觉调节的重要的中枢核团。Watanabe 等[10]报道伏核内灌注乙酰天冬氨酸可明显减轻光刺激诱发的感觉神经损伤引起的疼痛。最近的研究报道神经痛大鼠伏核组织甘丙肽的表达上调[11]。本实验研究不同大鼠模型伏核微量注射甘丙肽的镇痛作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 研究材料

1.1.1 实验动物 SD 大鼠43 只：170～220 g，雄性，昆明医科大学实验动物学部提供。实验期间大鼠自由饮水、自由进食，分笼饲养、自然光照、室温保持在22 ℃左右。所有实验操作严格按照国际疼痛协会和昆明医科大学伦理委员会的规定执行。

1.1.2 实验试剂和仪器 甘丙肽（rat galanin，Tocris，UK）、Anti-GalR1（Thermo，美国）、Anti-GalR2（Abcam，英国）、Anti-GAPDH（CST，美国）。热板智能仪（Hot plate，YLS-6B，中国）、Randall-Selitto 痛觉测试仪（UGO Basile，37215，意大利）。

1.2 研究方法

1.2.1 痛觉行为学检测 大鼠对伤害性热刺激诱发的后爪缩爪潜伏期（hind-paw withdrawal latency，HWL）使用热板智能仪测定，热板温度保持在（52±0.2）℃。对机械压力刺激诱发的后爪缩爪阈值（hind-paw withdrawal threshold，HWT）使 用Randall-Selitto 痛觉测试仪测定。

实验前对大鼠进行5 d 的训练，使大鼠HWL和HWT 较为稳定，以减少实验误差。

1.2.2 动物模型的建立 实验采用鹿角菜碱制作炎症痛模型。在实验当天，将2%的鹿角菜碱0.1 mL 注射到大鼠左侧后爪足底皮下。鹿角菜碱注射3～4 h 之间，大鼠痛敏达到高峰。

采用坐骨神经干部分结扎（chronic constriction injury，CCI）的方法制作神经痛动物模型。大鼠麻醉用戊巴比妥钠（50 mg/kg，腹腔注射）后，游离左侧约1 cm 长的坐骨神经大腿段，轻度结扎神经（4 号羊肠线），共结扎4 圈，每圈之间间隔约1 mm。

1.2.3 伏核埋管 麻醉后，将大鼠固定在脑立体定位仪上。根据大鼠的脑定位图谱（B，+1.7 mm；L or R，1.6 mm；V，7.0 mm），将事先准备好的不锈钢套管（外径为0.8 mm）放置于伏核内，并使用牙托粉固定套管。术后大鼠恢复2～3 d。

1.2.4 伏核微量注射 实验当天进行伏核内微量注射，注射管为外径0.4 mm 的不锈钢管。

实验分为生理盐水对照组（n=8）、正常组（n=8）、炎症痛组（n=8）和CCI 组（n=7），生理盐水对照组大鼠伏核注射1 µL 生理盐水；正常组大鼠伏核注射1 nmol 的甘丙肽1 µL；炎症痛给药组大鼠在致炎3 h 伏核注射1 nmol 的甘丙肽1 µL；CCI 给药组大鼠在坐骨神经结扎第14 天伏核注射1 nmol 的甘丙肽1 µL。

注射前，需测量双侧HWL 和HWT 作为基础值，在甘丙肽注射5、10、15、20、30、45、60 min 后分别测量各组大鼠双侧的HWL 和HWT，计算给药后变化百分率，即：

实验结束后对伏核注射位点进行组织学鉴定（图1），鉴定结果显示注射位点位于伏核的数据方可纳入统计。

图1 伏核注射位点鉴定图Fig.1 Illustration of the location of the injection needle tips

1.2.5 蛋白质印迹法（western blot，WB）大鼠用4%的异氟醚麻醉后，迅速取双侧伏核组织。WB 法检测GalR1（1∶500）和GalR2（1∶500）的表达。以 GAPDH（1∶10 000）作为内参，蛋白表达条带使用Image J 软件分析。

1.3 统计学处理

所有数据采用“均数±标准误”表示，数据统计分析使用Prism6 软件分析。组间差异采用重复测量双因素方差分析或单因素方差分析进行比较。检验标准为α=0.05，P＜ 0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甘丙肽对正常大鼠、炎症痛大鼠和神经痛大鼠的镇痛作用

和生理盐水对照组比较，伏核注射甘丙肽引起正常组（左：F=5.76，P＜ 0.05；右：F=10.66，P＜ 0.01）、炎症痛组（左：F=54.94，P＜ 0.001；右：F=37.92，P＜ 0.001）和CCI 组（左：F=68.13，P＜ 0.001；右：F=33.90，P＜ 0.001）大鼠双侧HWL 延长，并且正常组（左：F=26.20，P＜ 0.001；右：F=13.71，P＜ 0.01）、炎症痛组（左：F=5.51，P＜ 0.001；右：F=21.94，P＜ 0.001）和CCI 组（左：F=79.63，P＜ 0.001；右：F=30.03，P＜ 0.001）大鼠双侧HWT 也延长。表明伏核注射甘丙肽对正常大鼠、炎症痛大鼠和神经痛大鼠都有镇痛作用，在注射甘丙肽10 min 时镇痛作用达到高峰，见图2。

2.2 甘丙肽对正常大鼠、炎症痛大鼠和神经痛大鼠的镇痛作用比较

以上结果显示，在伏核注射甘丙肽后10 min镇痛作用达最高峰。比较3 组大鼠在伏核注射甘丙肽10 min 时的HWL 和HWT，结果显示和正常组比较，炎症痛组（左：q=4.45，P＜ 0.05；右：q=5.00，P＜ 0.05）和CCI 组（左：q=4.95，P＜0.05；右：q=4.52，P＜ 0.05）的双侧HWL 延长。炎症痛组（左：q=5.89，P＜ 0.01；右：q=4.96，P＜ 0.05）和CCI 组（左：q=7.98，P＜ 0.001；右：q=6.82，P＜ 0.001）的双侧HWT 也延长，表明伏核注射甘丙肽对炎症痛鼠和神经痛鼠的镇痛作用强于正常鼠的。但比较炎症痛鼠和CCI 鼠的HWL（左：q=0.65，P＞ 0.05；右：q=0.31，P＞0.05）和HWT（左：q=2.3，P＞ 0.05；右：q=2.02，P＞ 0.05）差异无统计学意义，见图3，提示致炎或神经损伤可能引起GalRs 的表达增加，甘丙肽通过和其受体结合完成镇痛作用。

图3 甘丙肽对正常大鼠、炎症痛大鼠和神经痛大鼠的镇痛作用比较Fig.3 Comparison of analgesic effects of galanin on native,inflammatory and CCI rats

2.3 炎症痛和神经痛对伏核神经细胞GalRs 表达的影响

为了进一步验证甘丙肽是否通过和其受体结合对大鼠具有镇痛作用。取正常组（n=4）、炎症痛组（致炎3 h，n=4）和神经痛组（CCI 第14 天，n=4）大鼠的伏核组织，WB 检测3 组大鼠伏核神经元GalR1 和GalR2 的表达。结果显示，和正常组比较，炎症痛大鼠伏核神经元GalR1（q=10.61，P＜ 0.001）和GalR2（q=5.47，P＜ 0.05）的表达增加。和正常组比较，CCI 大鼠伏核神经元GalR1（q=12.47，P＜ 0.001）和GalR2（q=4.95，P＜0.05））的表达也增加。该结果表明致炎或神经损伤引起GalR1 和GalR2 的表达增加，但比较炎症痛大鼠和CCI 大鼠的GalR1（q=1.86，P＞ 0.05）和GalR2（q=0.53，P＞ 0.05），差异无统计学意义（P＞ 0.05），见图4。

图4 正常大鼠、炎症痛大鼠和神经痛大鼠 GalR1 和GalR2 的表达Fig.4 Expression of GalR1 and GalR2 in native,inflammatory and CCI rats

3 讨论

脑内与痛觉相关的中枢部位检测到甘丙肽的表达，提示甘丙肽在痛觉的产生和传导中起到重要作用[5]。Zhang 等[12-13]报道前扣带回（Anterior cingulate cortex）注射甘丙肽对炎症痛大鼠和神经痛大鼠具有镇痛作用。Li 等[14]报道中央杏仁核（Central nucleus of amygdala）注射甘丙肽对正常大鼠和神经痛大鼠具有镇痛作用。本实验选取正常大鼠、炎症痛大鼠和神经痛大鼠不同动物模型，伏核注射相同剂量的甘丙肽，结果显示甘丙肽引起3 组大鼠双侧HWL 和HWT 都延长（图2），提示伏核注射甘丙肽对正常大鼠、炎症痛大鼠和神经痛大鼠都具有镇痛作用。并且比较甘丙肽对不同大鼠的镇痛作用，结果显示甘丙肽对炎症痛大鼠和神经痛大鼠的镇痛作用强于对正常大鼠的镇痛作用（图3），提示在炎症和神经损伤过程中，GalRs 的表达可能上调，甘丙肽可能是通过激活其受体，从而抑制痛觉信息的传导。

伏核是脑内调节痛觉的最重要的核团之一。大鼠伏核内注射降钙素基因相关肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）具有镇痛作用[15]。本实验选取正常大鼠、炎症痛大鼠和神经痛大鼠不同动物模型，伏核内注射相同剂量的甘丙肽，结果显示甘丙肽引起3 组大鼠双侧HWL 和HWT 都延长，见图2。提示伏核注射甘丙肽对正常大鼠、炎症痛大鼠和神经痛大鼠都具有镇痛作用。

既往研究报道，甘丙肽通过激活一种或几种甘丙肽受体而发挥作用[16]，在中枢神经系统已经检测到甘丙肽与其受体的结合[17]。为了研究甘丙肽在伏核对痛觉信息的抑制作用是否通过激活甘丙肽受体来完成，本实验首先比较伏核注射相同剂量的甘丙肽10 min 后对不同大鼠模型的镇痛作用，结果显示甘丙肽对炎症痛大鼠和神经痛大鼠的镇痛作用强于对正常大鼠的镇痛作用，见图3。这一结果提示在炎症和神经损伤过程中，GalRs的表达可能上调，甘丙肽通过和受体结合完成镇痛作用，因而对炎症痛和神经痛大鼠的镇痛作用强于对正常大鼠的镇痛作用。

GalRs 属于G 蛋白耦联受体[18]。先前的研究也报道在一些痛觉过敏的状态下，比如神经损伤，甘丙肽和其受体的表达都是增加的[13,19]。Xu 等[20]报道坐骨神经损伤引起脊髓背根神经节GalR1 的表达下调；但在脊髓，GalR1 的表达是上调的；GalR2 的表达则在脊髓背根神经节和脊髓神经细胞都是上调的。Zhang 等[11]报道伏核注射GalRs的共同阻断剂Galantide 能阻断甘丙肽对神经痛的镇痛作用；而伏核内微量注射GalR1 的特异性激动剂M617 对神经痛大鼠具有镇痛作用[7]；在CCI 大鼠[21]和炎症痛大鼠[22]伏核内注射GalR2的特异性激动剂M1145 也具有镇痛作用。这些研究都提示在痛敏状态下可能脑内GalRs 激活，从而抑制痛觉信息的产生而具有镇痛作用。本实验检测正常大鼠、炎症痛和神经痛大鼠3 种不同动物模型的伏核神经细胞GalR1 和GalR2 的表达，结果显示和正常组大鼠比较，炎症痛和神经痛大鼠GalR1 和GalR2 的表达上调，见图4，进一步表明在炎症和神经损伤过程中，神经细胞GalR1和GalR2 被激活。本实验未能检测到伏核神经细胞GalR3 的表达。

综上所述，伏核注射甘丙肽对炎症痛和神经痛大鼠的镇痛作用强于对正常大鼠的镇痛作用；在炎症和神经损伤过程中，伏核神经元GalR1 和GalR2 的表达增加。这些结果表明甘丙肽通过和其受体结合完成镇痛作用。随着对甘丙肽镇痛作用及其机制的深入研究，甘丙肽及其受体激动剂可望成为临床治疗疼痛的新型镇痛药物。