背角无齿蚌对养殖水体亚硝酸盐氮的净化效果

端国超,阎明军,陈修报,,,姜 涛,刘洪波,侯诒然,杨 健

(1 南京农业大学无锡渔业学院,无锡 214081;2 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心,渔业微化学实验室,无锡 214081;3 农业农村部稻渔综合种养生态重点实验室,无锡 214081)

淡水贝类背角无齿蚌(Anodontawoodiana)原产于中国长江和黑龙江流域[10],现已广泛分布于中国各地区乃至亚洲、欧洲、北美洲和非洲[11-14],具有食用、药用和培育珍珠等重要经济价值[11]。此外,因其具有滤水能力强、生长过程无需额外投饲、抗逆性强且对污染物具有高吸收和低代谢性等特点,被认为是优良的水质净化物种[11-12]。研究表明,背角无齿蚌能够有效净化水体中的微藻、悬浮颗粒物和重金属(如铜、镉、铝、铬)[15-17];对于氮、磷的净化效果则受到蚌养殖密度、处理时间及水体富营养化程度等因素影响变动较大[16-18]。例如,陈修报等[18]和Kim等[19]通过构建微型生态系统发现背角无齿蚌对水体低含量亚硝酸盐氮(0.001～0.008 mg/L)影响不明显;李萍[20]研究结果显示背角无齿蚌对水体较高含量亚硝酸盐氮(0.43±0.04 mg/L)显示出净化作用,且去除率可达到55.8%。然而,背角无齿蚌的养殖密度、处理时间与亚硝酸盐氮净化效果之间的耦合关系尚不清楚。

本研究拟通过构建亚硝酸盐氮污染的微型生态系统,探究亚硝酸盐氮胁迫下背角无齿蚌的滤水率变化,及其不同养殖密度和处理时间对亚硝酸盐氮净化效果的耦合效应,为养殖水体亚硝酸盐氮生物净化以及养殖尾水达标排放提供参考。

1 材料与方法

1.1 背角无齿蚌来源

背角无齿蚌来自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心南泉养殖基地,挑选24只同批繁养的规格相似的个体,壳长为11.8±0.5 cm,活体质量为117.5±29.0 g。其中,6只蚌用于测定滤水率,试验前在曝气72 h的自来水中暂养1周;其余18只蚌用于亚硝酸盐氮净化效果试验,试验前在200目纱绢过滤过的池塘水中暂养1周。暂养期间,水温控制在25.0±1 ℃;每天投喂一次密度约为106cells/mL小球藻(Chlorellavulgaris),摄食3 h后进行全部换水。

1.2 滤水率的测定

将用于测定滤水率的6只背角无齿蚌随机均分为空白组和亚硝酸盐氮暴露组。空白组的养殖用水为曝气72 h的自来水,亚硝酸盐氮含量未检出。鉴于江河、湖泊、水库和池塘等养殖水体中亚硝酸盐氮含量一般不超过1.0 mg/L[2],因此,亚硝酸盐氮暴露组通过向曝气自来水中加入亚硝酸钠(分析纯,国药集团化学试剂有限公司)配制成亚硝酸盐氮理论质量浓度为1.0 mg/L的溶液。参考Zhang等[21]研究方法并略加改进,测定不同组别中背角无齿蚌的滤水率(Clearance rate,CR)。具体步骤如下:在2 L玻璃呼吸室中加入密度约为106cells/mL的小球藻,每个呼吸室中放入1只背角无齿蚌,摄食时间精准控制在1 h,显微镜检摄食前后呼吸室中小球藻密度变化。试验期间的水温保持在25.0±1 ℃。每个组别设置3个平行试验组。测定结束后,将蚌解剖取出软组织,于80 ℃干燥24 h并称重。滤水率的计算公式为[21]:

(1)

式中:V指呼吸室中水体的体积(L);C0指呼吸室中小球藻的初始密度(cells/mL);Ct指试验结束后呼吸室中小球藻的密度(cells/mL);W指背角无齿蚌软组织干重(g);T指试验持续时间(h)。

1.3 微型生态系统的建立

在室内建立12个微型生态系统。向12个规格为100 cm × 45 cm × 50 cm(长×宽×高)的玻璃缸分别注入100 L经75 μm孔径纱绢过滤的池塘水(取自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心南泉养殖基地池塘)。池塘水中亚硝酸盐氮的背景含量为0.006±0.002 mg/L。向各个玻璃缸中分别加入0.15 g亚硝酸钠(分析纯,国药集团化学试剂有限公司)配制成亚硝酸盐氮理论质量浓度为1.0 mg/L的养殖水体。之后,参考已报道的背角无齿蚌净化水质的养殖密度[18,20]及预试验结果,设置低(放入1只蚌;养殖密度为10只/m3)、中(放入2只蚌;养殖密度为20只/m3)和高(放入3只蚌;养殖密度为30只/m3)密度处理组,并设置对照组(不放蚌;养殖密度为0只/m3)。每个组别均设置3个平行试验组。此外,依据魏小飞等[16]研究结果表明背角无齿蚌在短时间内(48 h)可有效净化水体中的总氮,设定试验周期为96 h。试验过程中不投饲,不增氧,水温控制在25±1 ℃。试验期间无蚌死亡现象。

1.4 养殖水体亚硝酸盐氮含量的测定

在净水试验起始点(0 h)及开始后的24、48、72和96 h,分别于微型生态系统的中央位置虹吸50 mL养殖水体,储存在聚丙烯采样瓶中。之后,用去离子水补齐微型生态系统中的养殖水体至100 L。然后,使用DR6000型多参数水质分析仪(美国,哈希公司),应用重氮化方法,测定养殖水体中亚硝酸盐氮的含量。

1.5 去除率和净化效率的计算方法

鉴于微型生态系统中亚硝酸盐氮受到环境因素和背角无齿蚌作用的共同影响,因此,应用去除率(Removal efficiency,RE)[22]分析背角无齿蚌对亚硝酸盐氮的净化程度:

(2)

式中:CB是各时间点对照组养殖水体中亚硝酸盐氮的含量(mg/L);CT是各时间点不同养殖密度蚌处理组养殖水体中亚硝酸盐氮的含量(mg/L)。RE>0表示蚌能够对亚硝酸盐氮起到去除作用,而RE<0表示亚硝酸盐氮含量不降反升。

进而,应用净化效率(Purification efficiency,PE)[23]分析背角无齿蚌对亚硝酸盐氮的净化能力:

(3)

式中:CB是各时间点对照组养殖水体中亚硝酸盐氮的含量(mg/L);CT是各时间点不同养殖密度蚌处理组养殖水体中亚硝酸盐氮的含量(mg/L);V是指微型生态系统中水体积(L);t是指处理时间(h);W指蚌软组织干重(g)。

1.6 统计分析

应用SPSS 25.0统计软件的独立样本T检验,比较空白组和亚硝酸盐氮暴露组中背角无齿蚌的滤水率;用单因素方差分析(one-way ANOVA),比较微型生态系统的对照组和不同养殖密度蚌处理组中养殖水体亚硝酸盐氮含量,蚌对亚硝酸盐氮的去除率(RE),以及蚌对亚硝酸盐氮净化效率(PE)之间的差异;用双因素方差分析(two-way ANOVA),检测RE、PE与蚌养殖密度和处理时间之间的关联性。P<0.05表示差异水平显著。此外,用Design-Expert 10.0统计软件的最小二乘法拟合RE、PE与蚌养殖密度和处理时间之间的回归关系,并用响应面分析法(response surface methodology)验证RE和PE。

2 结果

2.1 背角无齿蚌滤水率变化

空白组中背角无齿蚌的滤水率为232.1±122.3 L/(h·kg),变化范围为94.6～328.7 L/(h·kg)。在亚硝酸盐氮暴露组中,背角无齿蚌的滤水率为69.0±17.7 L/(h·kg),变化范围为58.0～89.5 L/(h·kg)。虽然亚硝酸盐氮暴露组中背角无齿蚌的平均滤水率低于空白组,但是两者并未达到显著差异水平(P>0.05)。

2.2 背角无齿蚌对亚硝酸盐氮的净化效果

2.2.1 亚硝酸盐氮含量变化

表1所示,对照组亚硝酸盐氮含量在试验期间没有发生显著变化(P>0.05);低密度处理组(10只/m3)亚硝酸盐氮含量在72 h和96 h显著低于24 h和48 h(P<0.05);中密度处理组(20只/m3)亚硝酸盐氮含量在试验期间亦没有发生显著变化(P>0.05);而高密度处理组(30只/m3)亚硝酸盐氮含量在72 h和96 h显著低于24 h和48 h(P<0.05)。表1所示,24 h后不同组别之间亚硝酸盐氮含量没有显著差异(P>0.05);48 h和72 h后低密度处理组亚硝酸盐氮含量均显著低于对照组(P<0.05)和中密度处理组(P<0.05);96 h后低密度处理组亚硝酸盐氮含量与高密度处理组之间没有显著差异(P>0.05),但均显著低于对照组(P<0.05)和中密度处理组(P<0.05)。综合不同组别和处理时间可见,低密度组在处理96 h后亚硝酸盐氮含量最低。

表1 背角无齿蚌对养殖水体亚硝酸盐氮的净化效果

2.2.2 去除率变化

表1所示,低密度处理组和高密度处理组对亚硝酸盐氮的去除率随处理时间的增加而呈升高趋势,在96 h的去除率均显著高于24 h(P<0.05);中密度处理组对亚硝酸盐氮的去除率总体保持不变(P>0.05)。表1所示,24 h后不同组别对亚硝酸盐氮的去除率没有显著差别(P>0.05);48 h和72 h后低密度处理组的亚硝酸盐氮去除率显著高于中、高密度处理组(P<0.05);96 h后低、高密度处理组的亚硝酸盐氮去除率显著高于中密度处理组(P<0.05)。综合不同组别和处理时间可见,低密度组在处理96 h后亚硝酸盐氮去除率最高。

2.2.3 净化效率变化

表1所示,低、中和高密度处理组在试验期间对亚硝酸盐氮的净化效率均没有发生显著变化(P>0.05);24 h后低和高密度处理组的亚硝酸盐氮净化效率显著高于中密度处理组(P<0.05);48 h、72 h和96 h后低密度处理组的亚硝酸盐氮净化效率显著高于中、高密度处理组(P<0.05)。综合不同组别和处理时间可见,低密度组在处理48 h和96 h后亚硝酸盐氮净化效率最高。

2.3 响应面分析法对去除率和净化效率的验证

应用响应面分析法建立亚硝酸盐氮去除率(RE)、净化效率(PE)与背角无齿蚌养殖密度(d)和处理时间(t)之间的回归模型(图1)。

图1 背角无齿蚌对养殖水体亚硝酸盐氮的去除率

该模型P<0.05,表明其能够有效耦合RE、PE与d和t之间的响应关系。相应的回归方程为:

RE=166.671 17-168.944d-1.207 12t-0.037 058dt+40.830 5d2+0.016 07t2(R2=0.772 8)

PE=232.615 83-223.582 5d+0.493 82t-0.068 729dt+48.691 25d2-0.000 84t2(R2=0.956 0)

据此得出d和t的配比为10只/m3和96 h时,RE和PE达到最大值,分别为67.215 7%和90.746 6 mg/(h·kg)。这与微型生态系统试验结果一致。

2.4 影响净化效果的因子分析

由表2可见,背角无齿蚌对养殖水体亚硝酸盐氮含量的影响与养殖密度和处理时间显著相关(P<0.05),而与两者的交互作用关系不显著(P>0.05)。对亚硝酸盐氮的去除率与养殖密度和处理时间显著相关(P<0.05),而与其交互作用关系不显著(P>0.05)。亚硝酸盐氮的净化效率与养殖密度显著相关(P<0.05),而与处理时间及养殖密度和处理时间的交互作用相关性不显著(P>0.05)。

表2 背角无齿蚌的养殖数量和处理时间对养殖水体亚硝酸盐氮净化效果的影响

3 讨论

3.1 背角无齿蚌滤水率的变化特征

背角无齿蚌具有强大的滤水能力。本研究中空白组背角无齿蚌的滤水率为232.1±122.3 L/(h·kg),与Zhou等[23]报道的背角无齿蚌平均滤水率为260 L/(h·kg)基本一致。此外,背角无齿蚌的滤水率显著高于其他淡水贝类如三角帆蚌(Hyriopsiscuming)[24]。通过滤水作用,背角无齿蚌等水生动物能够直接吸收水体中的溶解态污染物[2,5],也可以通过滤食藻类等间接吸收水环境中颗粒态/结合态污染物。因此,背角无齿蚌可以通过强大的滤水率发挥水质净化作用。值得注意的是,背角无齿蚌的滤水率会受到环境因素(如水温、污染胁迫)的影响[23-24]。本研究显示背角无齿蚌受到亚硝酸盐氮暴露后滤水率呈下降趋势,这可能与亚硝酸盐氮产生毒性作用致使背角无齿蚌启动闭壳保护有关。尽管如此,可引起大部分养殖动物死亡的1.0 mg/L亚硝酸盐氮[3],并未显著降低背角无齿蚌的滤水率,说明背角无齿蚌对亚硝酸盐氮具有高耐受性。Soucek等[25]研究发现淡水贝类对亚硝酸盐氮普遍具有高耐受性,如亚硝酸盐氮对淡水丽蚌Lampsilissiliquoidea的96 h-LC50高达176.5 mg/L。背角无齿蚌对亚硝酸盐氮的耐受程度及其耐受机制有待进一步研究。

3.2 背角无齿蚌对亚硝酸盐氮的净化效果

本研究中所有微型生态系统处于相同的时空环境中,试验期间水体亚硝酸盐氮含量表现出的差异应归因于背角无齿蚌养殖密度和处理时间的不同。其中,亚硝酸盐氮的最高含量(0.66±0.12 mg/L)出现在中密度组处理48 h后,尽管如此,与对照组亚硝酸盐氮含量没有显著差异。而最低含量(0.20±0.06 mg/L)出现在低密度组处理96 h后,显著低于对照组亚硝酸盐氮含量,相应的去除率和净化效率分别为(64.99±10.32)%和90.16±13.54 mg/(h·kg)。响应面分析法验证了背角无齿蚌对亚硝酸盐氮去除率和净化效率的可靠性。表明背角无齿蚌能够对养殖水体较高的亚硝酸盐氮起到净化作用,这支持李萍[20]的研究结论。李萍[20]在背角无齿蚌的养殖密度为10只/m3、处理时间为43 d和58 d后,水体中的亚硝酸盐氮含量显著降低,且去除率可达到55.8%。值得注意的是,当养殖水体中亚硝酸盐氮含量较低时(如0.001～0.008 mg/L),背角无齿蚌难以对亚硝酸盐氮发挥净化作用甚至还会引起亚硝酸盐氮含量略微升高[18-19]。这应该是由于淡水贝类对水体中亚硝酸盐氮等物质循环是吸收、转化和排泄的动态过程[26],当水体中亚硝酸盐氮含量低于背角无齿蚌的正常代谢时,代谢产物如氨氮经氨氧化细菌硝化反应成亚硝酸盐氮释放到水体中导致的。在背角无齿蚌对水体总磷的净化中也存在类似的现象。吴中奎等[17]就发现背角无齿蚌对清水态水体中总磷难以起到净化作用,但是能够显著降低富营养化水体中总磷含量。

在实际应用中,鱼蚌混养能够促进养殖循环经济发展,实现经济效益和生态效益“双赢”[8-9]。例如,陈家长等[8]在循环水养鱼池塘中吊养三角帆蚌,在收获鱼和蚌的同时,还将养殖水体中亚硝酸盐氮含量降低16.95%～45.45%。因此,利用背角无齿蚌净化养殖水体/尾水中亚硝酸盐氮是可行的。

3.3 影响背角无齿蚌对亚硝酸盐氮净化效果的因素

基于模拟现实中受亚硝酸盐氮污染的养殖水体,本研究显示背角无齿蚌对亚硝酸盐氮含量与去除率均受到养殖密度和处理时间的显著影响,而净化效率仅受到养殖密度的显著影响,说明蚌养殖密度在养殖水体亚硝酸盐氮净化效果中起到更为关键的作用。Geng等[27]研究结果也显示养殖密度是三角帆蚌净化水体氨氮和总磷的关键因素。目前,尚未见关于不同养殖密度背角无齿蚌对亚硝酸盐氮污染水体净化效果的比较研究。李萍[20]将背角无齿蚌的养殖密度设置为10只/m3能够将水体亚硝酸盐氮去除55.8%。而本研究比较了低(10只/m3)、中(20只/m3)和高(30只/m3)养殖密度的背角无齿蚌及其不同处理时间对养殖水体亚硝酸盐氮的净化效果,证实了低养殖密度对亚硝酸盐氮的净化效果最佳。需要注意的是,过高的养殖密度[28]及亚硝酸盐氮产生的毒性作用[29],一方面可降低淡水贝类的滤水率[29],另一方面会增加淡水贝类的氮(包括氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮)排出率[30];氨氮和硝酸盐氮可分别经硝化反应和还原反应转化为亚硝酸盐氮[2];从而造成养殖水体中亚硝酸盐氮的吸收率甚至低于生成率的情形。因此,在利用背角无齿蚌净化养殖水体/尾水亚硝酸盐氮的过程中,要根据亚硝酸盐氮含量的实际情况设定适宜的蚌养殖密度。综合李萍[20]和本研究结果,建议将背角无齿蚌的养殖密度设定为10只/m3以净化养殖水体亚硝酸盐氮。此外,本研究显示背角无齿蚌在10只/m3的养殖密度下,对亚硝酸盐氮净化效果随着处理时间的延长而逐步增强,提示延长处理时间应该会进一步增强背角无齿蚌对亚硝酸盐氮的净化效果。

4 结论

本研究通过构建呼吸室和微型生态系统,发现背角无齿蚌对亚硝酸盐氮具有高耐受性,并能起到有效净化作用。背角无齿蚌对亚硝酸盐氮的去除率和净化效率分别可高达(64.99±10.32)%和90.16±13.54 mg/(h·kg)。在利用背角无齿蚌进行养殖水体/尾水的亚硝酸盐氮的净化过程中,建议将蚌养殖密度设定为10只/m3。