黄连对生物絮凝系统氨氮处理效率的影响

劳锦程,李佳洋,谭洪新,2,3,刘文畅,2,3,罗国芝,2,3

(1 上海海洋大学上海水产养殖工程技术研究中心,上海 201306;2 上海市水产动物良种创制与绿色养殖协同创新中心,上海 201306;3 上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心,上海 201306)

近年来,随着集约化养殖的快速发展,高密度养殖过程中病害频发,对健康绿色养殖和稳定持续发展造成了巨大的威胁[1]。弧菌作为水体中最常见的致病细菌[2],对规模化水产养殖的危害非常严重[3]。中草药取自于自然界,无化学添加、副作用相对较小[4],在水产动物疾病防治[5]和提高养殖动物生长[6]、消化[7]、免疫[8]和抗病[9]能力等方面起到良好的作用。黄连作为一种广谱性杀菌抑菌中草药,对多种水产致病菌具有抑制作用[10],其中对副溶血弧菌、溶藻弧菌、嗜水气单胞菌均有明显的抑制作用[11]。已有相关研究在水产养殖环境中添加了黄连根须[12]、黄连素[7],但仅局限于清水养殖环境。

在水产养殖中应用生物絮凝技术(Biofloc Technology,BFT) 正在国内外各地研究、实践并逐步推广[13]。除絮团微生物进行的同化作用外,硝化过程被证明也是BFT系统中氨氮的主要转化途径之一[14],原理是氨氧化微生物在氨单加氧酶(Ammonia Monooxygenase,AMO)催化下将氨氧化成羟氨之后,在羟氨氧化还原酶(Hydroxylamine Oxidereductase,HAO)作用下被氧化为亚硝酸盐氮,最后亚硝酸盐氮氧化细菌通过亚硝酸盐氧化还原酶(Nitrite Oxidereductase,NOR)将亚硝酸盐氮氧化为硝酸盐[15]。在生物絮团处理有机物时,脱氢酶(Dehydrogenase,DHO)是微生物降解有机物的必需酶[16]。因此脱氢酶活性的高低反映了生物絮团中微生物的数量和对养殖固体废弃物的分解能力。现阶段中草药对生物絮团微生物的影响相关研究较少,在BFT系统中氨氮的主要转化途径之一是絮团微生物进行的硝化过程[17],这一过程可能会受黄连等药物的影响。

本研究在生物絮团中添加不同浓度的中草药黄连添加剂,确定中草药黄连添加剂对生物絮凝系统氨氮处理效率的影响,为中草药在生物絮团养殖模式中的推广应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 生物絮团装置

试验共用12个容积为10 L的聚乙烯透明水桶作为絮团培养桶,每6个桶采用1台罗茨鼓风机(功率750 W,森森集团股份有限公司)进行曝气(图1)。

图1 本研究设备示意图

生物絮团采用上海海洋大学养殖技术与工程实验室具有良好硝化性能的成熟生物絮团[18],该生物絮团用鱼用膨化配合饲料(通威股份公司)培养,培养时间43 d,所用饲料含28%粗蛋白、12%粗纤维、5%粗脂肪、15%粗灰分、0.6%总磷以及12.5%水分。采用透明硅胶软管(内径5 mm,外径7 mm)搭配大马蹄气石进行曝气。絮团培养时以葡萄糖(C6H12O6)为碳源,采用碳酸氢钠(NaHCO3,总碱度99.0%～100.5%,桐柏博源新型化工有限公司生产)进行调节碱度。

1.2 试验设计

中草药提取液制备:黄连购自当地药材店,将黄连洗净后于60℃恒温干燥箱中烘至恒重,取50 g,放到洗净的烧杯中,加500 mL水,浸泡3 h以后煎煮,煮沸后文火保温30 min;然后将滤液移至锥形瓶,重复煎煮3次,合并滤液后浓缩至生药含量1 000 mg/mL,调pH至中性,置于4 ℃冰箱保存待用[19]。

2 试验指标与检测方法

2.1 水质指标测定

2.2 氨氮、亚硝酸盐氮去除率计算

STAN=(C1-C2)/(T×t)

(1)

SN=(C1-C2)/(T×t)

(2)

2.3 絮团采样及检测方法

锥形瓶试验结束时,每个10 L水桶取50 mL絮团,经高温灭菌的0.22 μm醋酸纤维滤膜过滤,将滤膜折叠放入灭菌离心管,置于-20℃冰箱存放待测。絮团的氨单加氧酶(AMO),羟氨氧化还原酶(HAO),亚硝酸盐氮氧化还原酶(NOR)和脱氢酶(DHO)含量的测定均采用ELISA试剂盒(上海哈灵生物科技有限公司)测定。

2.4 数据分析

试验数据采用Excel软件进行结果统计,采用Origin 8.5软件进行插图绘制。试验数值用平均值±标准差(Mean±SD)形式表示,采用SPSS 19.0统计软件对数据进行ANOVA 单因素方差分析,P<0.05为差异性显著。

3 结果

3.1 试验前初始水质指标

表1 各处理组主要水质指标

3.2 添加黄连前后TSS含量

如图2所示,发现添加黄连会使BFT系统水体中TSS质量浓度降低。初始未添加黄连状态下,各组之间不存在显著性差异(P>0.05);经添加黄连处理后,处理组的TSS含量均显著低于对照组,其中T3组又显著低于其余组(P<0.05)。

注:C组(0 g/L)、T1组(2 g/L)、T2组(4 g/L)、T3组(6 g/L),下同

3.3 氨氮和亚硝酸盐氮浓度

如图3所示,添加黄连处理组的TAN最终质量浓度均低于C组,T2组最低。

图3 各组总氨氮快速转化试验动态变化图

表2 各组生物絮团氨氮、亚硝酸盐氮去除速率

图4 各组亚硝酸盐氮快速转化试验动态变化图

3.4 生物絮团酶活指标

在絮团中添加黄连,氨单加氧酶(AMO)、羟胺氧化还原酶(HAO)及亚硝酸盐氮氧化还原酶(NOR)活性均有升高的趋势(图5)。其中,T2组的AMO、NOR质量浓度显著大于C组(P<0.05),T2和T3组的HAO浓度显著大于C组(P<0.05)。

图5 各组生物絮团中AMO(a)、HAO(b)、NOR(c)和DHO(d)的含量

在絮团中添加黄连,脱氢酶(DHO)活性均有先升高的趋势(图5)。其中,仅T3组显著大于C组(P<0.05)。

4 讨论

4.1 黄连对水质变化的影响

氨氮和亚硝酸盐氮是水产养殖过程中主要的代谢废物[26],高浓度的氨氮与亚硝酸盐氮会对养殖对象产生毒害作用,在养殖活动开始前有必要将生物絮团系统中的氨氮与亚硝酸盐氮降至低水平[27]。试验结果显示,在生物絮团中添加黄连,可加快氨氮降至低水平(图3),这与王洛洋等[28]的研究结果一致,中草药对减少水中氨氮含量有积极作用,在生物絮团中添加黄连不会引起水质的恶化,还能加快降低氨氮质量浓度(表2)。试验结果表明,在生物絮团中添加黄连对亚硝酸盐氮的去除有影响(图4),且与黄连的用量有关,当添加量到6 g/L时会抑制亚硝酸盐氮的转化过程(表2)。在添加黄连素养殖草鱼[8]、团头鲂、大口黑鲈[7]和日本蟳[9]等水产动物的研究中并未见因添加黄连素导致水质恶化的报道。结合絮团硝化酶测定结果发现,添加黄连能提高絮团硝化酶活性,而絮团在水质处理能力方面,硝化酶是氨氮转化途径中的关键酶,硝化酶活性的强弱是絮团微生物氨氮处理能力强弱的关键[29]。本研究表明,在生物絮团中添加适宜浓度的黄连能加快降低氨氮、亚硝酸盐氮浓度,提高絮团的氨氮处理效率,对BFT系统水质的稳定具有积极作用。

4.2 黄连对生物絮团硝化性能的影响

试验结果显示在絮团中添加黄连能够提高AMO和HAO活性(图5)。有关研究表明在BFT系统中氨氮的主要转化途径之一是絮团微生物进行的硝化过程[17],原理是氨氧化微生物在AMO催化下将氨氧化成羟氨之后,在HAO作用下被氧化为亚硝酸盐氮[29],本试验中经黄连处理后的絮团能更快地将氨氮氧化为亚硝酸盐氮;并且试验结果表明在絮团中添加黄连能够提高NOR活性(图5)。有关研究表明亚硝酸盐氮氧化细菌通过NOR将亚硝酸盐氮氧化为硝酸盐氮[29],本试验中经黄连处理后的絮团NOR活性增强,能更快地将亚硝酸盐氮氧化为硝酸盐氮。这可能是添加黄连抑制了絮团中的部分有害菌,使水体环境更利于硝化细菌生长,从而提升了絮团的硝化性能。

4.3 黄连对TSS的影响

TSS常用来衡量水体中固体有机颗粒物的含量[30]。本研究结果显示,添加黄连组的TSS均低于未添加组(图2),并且呈现出随添加浓度的增加而降低的趋势,说明添加黄连后,水体中固体有机颗粒物含量降低。这可能是因为添加黄连后,絮团DHO活性提高导致的。在生物絮团处理利用有机物时,脱氢酶(DHO)是微生物降解利用有机物的必需酶,脱氢酶活性反映了生物絮团中微生物的数量和对养殖固体废弃物的分解能力[16]。添加黄连组的DHO含量均高于未添加组(图5),并且呈现出随添加浓度的增加而升高的趋势,这说明添加黄连能提高生物絮团对养殖固体废弃物的处理能力,加快对BFT系统水体中残饲粪便的降解。结合TSS与DHO的变化趋势,可以看出添加黄连能提高絮团微生物DHO活性,提高了对水体中固体有机颗粒物的降解水平,从而降低了BFT系统水体中TSS。过高的TSS会对养殖生物产生胁迫,研究表明,当TSS浓度较高时,短盖肥脂鲤幼鱼生长减少,红细胞值改变,鳃形态受到影响,当系统中维持低水平TSS可以激活鳃内固有的非特异性免疫反应,减少寄生虫的存在[31]。Liu等[32]发现,TSS低于300 mg/L有利于凡纳滨对虾无节幼体的生长。本试验中添加黄连能减少BFT系统水体中TSS的积累,在养殖过程中能减少TSS对养殖生物的胁迫,特别是在养殖对象幼体培养阶段。

5 结论

中草药在水产养殖中的应用现阶段大多局限于清水养殖模式,本研究在生物絮团中添加黄连,发现适宜添加量的黄连能够提高絮团去除氨氮、亚硝酸盐氮的效率,能够提高生物絮团硝化酶活性,对生物絮团水处理能力无负面影响,以4 g/L的添加量最佳;试验过程中发现添加黄连能够显著降低生物絮团系统水体中TSS含量,提高絮团对水体中养殖固体颗粒物的降解能力,减缓水体中TSS的积累,防止过高TSS对养殖对象造成胁迫。应进一步研究黄连对生物絮团抑菌能力及应用于实际生产对养殖对象产生的影响。