复方功应草的急性和亚慢性毒性试验

张宜诺,凌 浩,颜 倩,孙乐乐,赵 莉,曾建国

(1.湖南农业大学动物医学院,湖南 长沙 410128 ; 2. 青岛农业大学化学与药学院,山东 青岛 266109)

复方功应草是由十大功劳、救必应、老鹳草、苦参和铁苋菜等药材经提取加工而成,具有清热解毒、燥湿止痢的功效,主要用于治疗大肠杆菌感染引起的仔猪湿热泻痢。为了评价和考察复方功应草的安全性,本试验根据《兽用化学中药研究技术指导原则汇编(2022年)》[1]和农业部1247号公告《兽药30天和90天喂养试验指导原则》[2],并参考《中药药理实验方法学》[3]和《药理实验方法学》[4]进行复方功应草的小鼠经口急性毒性试验和大鼠经口给药30 d的亚慢性毒性试验研究,以期为复方功应草的临床应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 受试药物 复方功应草粉末(批号为20220601,100 g/袋,1.4 g原生药可以制成1 g复方功应草粉末),实验室自制。药材提取方式:称取处方量的药材,加12倍量水煎煮1.5 h,滤过,药渣再加10倍量水煎煮1.5 h,水煎液滤过,合并,减压浓缩为相对密度为1.10～1.15的浸膏,喷雾干燥,粉碎成细粉,加无水葡萄糖调整总量至1 000 g,混匀,分装,即得。

1.2 实验动物 SPF级ICR小鼠48只,雌雄各半,体重18～22 g;4周龄SPF级SD大鼠80只,雌雄各半,体重90～120 g,均购于青岛市实验动物和动物实验中心[生产许可证号:SCXK(鲁)2022—0001]。

1.3 主要仪器 血常规管(批号20220102)、分离胶管(批号20220903),江苏宇力医疗器械有限公司产品;电子天平(型号SL302 N),上海民桥精密科学仪器有限公司产品;自动血球分析仪(型号XT-2000iv),日本希森美康东亚株式会社产品;日立全自动生化分析仪(型号7180ISE),日本日立高新技术株式会社产品;高速离心机(型号universal 320R),德国Hettich产品。

1.4 小鼠急性毒性试验

1.4.1 预试验 将8只ICR小鼠按照体重随机分成受试药物组和空白对照组2个组,每组4只小鼠(雌雄各半),灌胃前禁食不禁水12 h。受试药物组小鼠灌服复方功应草药液,每日1次,灌胃给药体积为0.2 mL/(10 g·bw),相当于10 g/(kg·bw)复方功应草;空白对照组灌服等量生理盐水。给药后4 h内连续观察记录2个组小鼠的表现,之后每日正常采食和饮水,上下午各观察1次小鼠表现,是否出现明显的毒副作用或死亡,连续观察7 d[5]。随后,将每组小鼠数量增加至10只(雌雄各半),试验方法同上,观察2个组小鼠是否出现明显的毒副作用或死亡。如果受试药物组的小鼠全部存活,未能测出复方功应草的半数致死量(Median lethal dose,LD50)值,说明该受试药物毒性很低,可按照《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》[6]进行最大给药剂量试验。

1.4.2 一天多次最大给药剂量试验 将20只ICR小鼠,按照体重随机分为受试药物组和空白对照组2个组,每组10只,雌雄各半,试验前禁食不禁水12 h。受试药物组小鼠灌胃给予复方功应草3次,每次间隔时间为3 h,每次灌胃体积为0.2 mL/(10 g·bw),3次合并灌胃剂量达到0.6 mL/(10 g·bw),即复方功应草给药剂量达到30 g/(kg·bw);空白对照组灌服等量生理盐水。给药后4 h内连续观察并记录小鼠表现,之后每日上下午各观察记录1次小鼠表现,连续观察7 d。观察内容包括呼吸、精神状态、采食、饮水和二便等一般状态,并详细记录动物的中毒表现和特点,毒性反应发生和消失时间,小鼠死亡时间,观察期结束后脱臼处死所有存活小鼠,进行眼观病理学检查[7]。

1.5 大鼠亚慢性毒性试验

1.5.1 试验分组和给药 根据《兽药30天和90天喂养试验指导原则》[2],将80只健康SD大鼠随机分为4个组,每组20只,雌雄各半。称重后,将复方功应草随机分配到3个试验组,即复方功应草高剂量组、中剂量组和低剂量组大鼠分别给予17.4、8.5和1.7 g/(kg·bw)的复方功应草,空白对照组以生理盐水灌胃,每天1次,连续30 d。

1.5.2 临床观察和检测

1.5.2.1 一般行为表现观察 试验期间每日观察大鼠的精神状态、营养状况、采食、饮水、运动行为、被毛、粪便和尿液等一般行为表现[8]。

1.5.2.2 体重、采食量和饮水量统计 所有大鼠每周称量1次体重和采食量,每天记录1次饮水量,计算每只大鼠每周的平均体重、平均采食量和平均饮水量。

1.5.2.3 血液学指标和血液生化指标检测 停药后24 h,各组分别取5只雄性和5只雌性大鼠,用水合氯醛[剂量为400 mg/(kg·bw)]进行麻醉,采血检查血液学和血液生化指标。

1.5.2.4 大体剖检病变观察和脏器系数测定 处死大鼠后,各组分别取5只雄性和5只雌性大鼠,摘取心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、胃肠、睾丸或卵巢,观察病变并称重,按照公式(1)计算脏器系数。

脏器系数=脏器重量(g)÷体重(g)×100

(1)

1.5.2.5 组织病理学检查 大鼠采血后及时处死,每组分别采集心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、胃肠、睾丸或卵巢,立即保存于10%福尔马林溶液内固定,制作石蜡切片,经苏木精-伊红(Hematoxylin-eosin,H.E.)染色对高剂量组和空白对照组大鼠各主要器官进行组织病理学检查,如发现病变,分别检查中、低剂量组大鼠的相应器官和组织[9]。

2 结果

2.1 小鼠急性毒性试验

2.1.1 预试验 复方功应草以10 g/(kg·bw)剂量经口灌服后,7 d内小鼠未见毒副作用和死亡,证明复方功应草属于实际无毒物质。

2.1.2 一天多次最大给药剂量试验 ICR小鼠单次给药剂量为10 g/(kg·bw),1 d内连续给药3次,使用剂量合并达到30 g/(kg·bw),7 d内所有小鼠均存活,且精神、采食、饮水和排便等正常,未出现中毒反应。观察期结束后处死存活小鼠,眼观病理学检查均未发现明显可见的病理变化。结果表明,小鼠以30 g/(kg·bw)剂量灌服复方功应草,无明显毒副作用,该剂量相当于大鼠以13.74 g/(kg·bw)剂量灌服,根据化学物急性毒性剂量分级表的规定,口服剂量介于5 001～15 000 mg/(kg·bw)属实际无毒[1]。

2.2 大鼠亚慢性毒性试验

2.2.1 一般行为表现观察 整个试验期间各组大鼠均没有出现任何异常现象,大鼠的精神状态、营养状况、被毛、行为表现、饮食和二便等一般行为表现均正常,无中毒和死亡情况。

2.2.2 体重统计 如表1所示,试验期间每周称量每组大鼠的体重,数据分析结果显示,与空白对照组相比,低剂量组、中剂量组和高剂量组每只大鼠的每周平均体重均无显著差异(P>0.05)。

表1 复方功应草对大鼠每周平均体重的影响Table 1 Effect of Compound Gongying Cao on average weekly body weight of rats

2.2.3 采食量统计 如表2所示,试验期间每周记录每笼大鼠的采食量,以周为单位进行统计,数据分析结果显示,与空白对照组相比,低剂量组、中剂量组和高剂量组每只大鼠的每周平均采食量均无显著差异(P>0.05)。

表2 复方功应草对大鼠每周平均采食量的影响Table 2 Effect of Compound Gongying Cao on average weekly feed intake of rats [g/(只·周),n=10]

2.2.4 饮水量统计 如表3所示,试验期间每天记录大鼠的饮水量,以周为单位进行统计,数据分析结果显示,与空白对照组相比,低剂量组、中剂量组和高剂量组每只大鼠的平均饮水量均无显著差异(P>0.05)。

表3 复方功应草对大鼠平均饮水量的影响Table 3 Effect of Compound Gongying Cao on water intake of rats [mL/(只·天),n=10]

2.2.5 血液学指标和血液生化指标检测 停药24 h后,每组随机抽取10只大鼠(雌雄各半)进行血液学指标和血液生化指标检测,数据分析结果如表4和表5所示,与空白对照组相比,低剂量组、中剂量组和高剂量组大鼠各血液学指标和血液生化指标检测结果无显著差异(P>0.05),表明复方功应草对大鼠的血液学指标和血液生化指标无不良影响。

表4 复方功应草对大鼠血液学指标的影响Table 4 Effect of Compound Gongying Cao on hematological parameters of rats

表5 复方功应草对大鼠血液生化指标的影响Table 5 Effect of Compound Gongying Cao on blood biochemical parameters of rats

2.2.6 大体剖检病变观察和脏器系数测定 试验结束后,每组随机抽取10只大鼠(雌雄各半),称重,剖杀,进行大体剖检观察,结果显示,各组大鼠均未发生眼观病变,主要脏器的大小和色泽均无异常,也无肿胀、出血或坏死等病变。统计分析心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、胃肠、睾丸或卵巢的脏器系数,结果如表6所示,与空白对照组相比,低剂量组、中剂量组和高剂量组大鼠各脏器系数均无显著差异(P>0.05),表明复方功应草对大鼠脏器组织无不良影响。

表6 复方功应草对大鼠脏器系数的影响Table 6 Effect of Compound Gongying Cao on organ coefficients of rats

2.2.7 组织病理学检查 采血后,处死各组大鼠,将各组大鼠的心脏、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、胃肠、睾丸或卵巢分别用10%福尔马林溶液固定,制作石蜡组织切片,H.E.染色后经显微镜观察,结果如图1所示,与空白对照组相比,高剂量组大鼠的上述脏器没有出现瘀血、出血、变性、坏死和炎症等病理性变化,即高剂量复方功应草未给大鼠造成病理组织学损伤。

3 讨论

3.1 复方供应草的急性毒性试验 复方供应草是以主要成分为十大功劳、救必应、老鹳草、苦参和铁苋菜等中药制得的中药复方散剂,其成分无毒,相互之间不存在“十八反,十九畏”等相关配伍禁忌。

李燕婧等[10]对长柱十大功劳水提物进行急性毒性研究,结果显示,长柱十大功劳水提物的最大给药量为402.00 g/(kg·bw),毒性很低;徐春生等[11]进行了救必应提取物的急性毒性试验,结果显示,按照急性毒性数据分级,救必应提取物属实际无毒级物质;崔颖等[12]通过老鹳草乙醇提取物的急性毒性试验,得到昆明系小鼠灌服老鹳草乙醇提取物剂量达到30 g/(kg·bw)时,其精神和活动等未见异常,说明小鼠的最大耐受量大于30 g/(kg·bw)(相当于750 g/kg生药材),可以判定老鹳草乙醇提取物属于实际无毒物质。急性毒性试验是为了观察给药后动物的毒性反应和死亡情况,在1 d内一次性或多次给药的试验方法[13]。急性毒性试验是评价药物安全性的重要指标,其结果为后续的亚慢性毒性试验提供理论基础[14]。在复方供应草的急性毒性试验的预试验中,复方功应草的给药剂量达到10 g/(kg·bw)时,小鼠未见毒副作用和死亡;一天多次最大给药剂量试验中,给药剂量合并达到30 g/(kg·bw)时,连续观察7 d,所有小鼠均存活,且精神、采食、饮水和排便等均正常,未出现中毒反应或死亡的情况。

3.2 复方供应草的亚慢性毒性试验 亚慢性毒性试验是评价药物临床应用前安全性的重要部分,本试验对复方供应草进行了30 d的亚慢性毒性试验,试验设置复方供应草高剂量组[17.4 g/(kg·bw)]、中剂量组[8.5 g/(kg·bw)]、低剂量组[1.7 g/(kg·bw)]和空白对照组,考察长期使用不同剂量的复方供应草是否会产生毒副作用、对组织器官造成一定损失以及影响其他临床评价指标[15,16]。结果显示,大鼠长期服用复方供应草均未出现任何异常现象,大鼠的精神状态、营养状况、皮毛、行为表现、饮食和二便等一般行为表现各项指标均正常,无中毒和死亡情况;复方功应草的3个剂量组大鼠的每周平均体重、采食量和饮水量与空白对照组均无明显差异(P>0.05),表明复方功应草对大鼠体重、采食量和饮水量无不良影响。

血液学指标、血液生化指标和脏器系数是评价药物毒性的常用指标,可在一定程度上反应该药物对动物脏器的影响程度[17-19]。徐春生等[20]进行了救必应提取物的安全性研究,结果显示,救必应提取物在经口反复接触时是安全的。本试验结果显示,复方供应草低、中、高3个剂量组大鼠的血液学指标、血液生化指标和脏器系数与空白对照组无显著差异(P>0.05),表明复方功应草对大鼠血液学指标、血液生化指标和脏器组织无不良影响。

组织病理学检查是目前临床医学领域常用的一种诊断方式[21]。秦哲等[22]对野老鹳草乙醇提取物的亚慢性毒性作用进行了初步研究,结果显示,给大白鼠灌服野老鹤草乙醇提取物对大白鼠的主要脏器没有产生明显毒性作用和病理性损害。本试验对复方供应草高剂量组和空白对照组大鼠的主要器官组织进行病理学检查均未发现异常,经显微镜观察,没有发现坏死、炎症等病理性变化,表明受试药物复方功应草有较高的安全性,无亚慢性毒性。

4 结论

综上所述,小鼠经口染毒,LD50大于10 g/(kg·bw),连续3次经口染毒累积剂量达到30 g/(kg·bw),小鼠无明显中毒反应,证明复方功应草属实际无毒。复方功应草按照高[17.4 g/(kg·bw)]、中[8.5 g/(kg·bw)]和低[1.7 g/(kg·bw)]3个剂量给大鼠灌胃,每日1次,连用30 d,对受试大鼠的体重、采食、饮水和一般行为均无不良影响;对血液学指标、血液生化指标和主要器官的脏器系数无不良影响;对高剂量组大鼠的主要脏器组织病理学检查未发现异常,复方功应草对主要器官无不良影响,表明在30 d内受试药物复方功应草有较高的临床用药安全性。