淫羊藿多糖对牛冷冻精液的影响

苗耀天，马 强，张 晋，曹振卿，董 伟

（1.武威市畜牧兽医总站，甘肃武威 733000；2.甘肃省家畜繁育改良管理站，甘肃武威 733000；3.武威市畜牧兽医科学研究院，甘肃武威 733000 ）

淫羊藿是中国常见传统补阳药，具有补肾助阳的功效。药理研究表明，淫羊藿多糖有多种生物活性，具有抗氧化、增强机体生殖能力等功能[1]。淫羊藿是常见中药材，生长于海拔1560～3100m 高度的山地，主要产于山西、陕西北部和甘肃东南部。多糖是淫羊藿的主要活性成分，不同形式的淫羊藿多糖在调节机体的各种生理病理途径中发挥了独特的生物学功能[2]。有研究指出，淫羊藿多糖能够在精子抗氧化和调节机体生殖功能中发挥作用[3]。牛冷冻精液是一项非常完善的技术，然而在低温保存精液的过程中，精子的活力、生存能力和受精率在相当大的程度上受到损害。已有研究表明，在稀释液的配制过程中，用具有抗氧化作用的中药有效成分来取代抗生素，可以在杀菌的同时抑制精子冷冻时的抗氧作用[4]。本研究旨在分离纯化淫羊藿有效成分淫羊藿多糖，并评估淫羊藿多糖对牛精子冷冻效果的影响，以及对牛精子膜完整性、活力和人工授精受胎率的影响。

1 试验材料

1.1 仪器

电热套（国华电器有限公司），冷凝回流装置（国华电器有限公司），层析柱，BSZ-160 自动部分收集器；实验室专用超纯水机CREAT，SHZ循环水真空泵，精子密度仪、显微镜、冷冻程控仪和封装打印机等冷冻精液设备，液氮罐和液氮由甘肃家畜繁育改良管理站提供；人工授精母牛，配种设备由武威市凉州区城西肉牛专业养殖合作社提供。2kg 淫羊藿购自武威市同仁堂药店。

1.2 试剂

主要试剂：95%乙醇、正丁醇、氯仿、苯酚、浓硫酸、考马斯亮蓝、葡萄糖标准品、牛血清蛋白标准品和稀释液等，由甘肃省家畜繁育改良管理站提供。

2 方法

2.1 淫羊藿多糖的提取

2.1.1 打粉取药店购买的淫羊藿2kg，制成淫羊藿粉末，装入双层纱布药袋，扎牢袋口。

2.1.2 除杂、水提醇沉

加入95%的乙醇没过淫羊藿粉末，170℃煮沸2～3h，重复多次直至煮出液颜色明显变浅。将干燥后滤出的淫羊藿粉末用双蒸水煮沸，2～3h 滤出淫羊藿粉末，重复多次直至煮出液颜色变为茶色，最后将所有煮出液浓缩至1L，待其冷却后，添加95%的乙醇沉淀并过夜，得到粗多糖。

2.2 淫羊藿粗多糖的分离纯化

2.2.1 Sevage 法脱蛋白

用正丁醇和氯仿反复沉淀离心除去蛋白，分液漏斗滤去有机溶剂，重复多次直至没有沉淀生成。95%乙醇沉淀过夜，得到去完蛋白杂质的淫羊藿粗多糖。

2.2.2 DEAE Fast Flow 柱层析

采用280mL 柱床体积的层析柱，称取6g 淫羊藿粗多糖溶于60mL 蒸馏水里，充分搅拌。

（1）装柱

旋紧层析柱的下方，使其呈单向封闭状态，向柱内注入约1/4 柱体积的蒸馏水。反复混匀填料,并缓慢倒入柱内，待其自然沉降。沉降过夜后打开出水口，调节流速，等到液面降至胶面2～3cm 时，再旋紧层析柱下方关闭出水口，继续添加填料，重复上述操作直至填料体积到达层析柱体积的85%，在整个灌注过程中保证胶的均匀，胶内无气泡，若存在气泡或者纹路则重新装柱。

（2）平衡

旋紧层析柱上下进出水口，再将上方进水口导管插入蒸馏水中，使流速保持在适当的范围内，均衡约3 个层析柱的柱床体积。

（3）上样

将层析柱进水口导管从蒸馏水中取出，待柱内蒸馏水流至胶表面，用50mL 注射器加入1/20柱体积的配制好的淫羊藿粗多糖溶液，沿层析柱管壁缓慢匀速加入多糖样品，调整液体流速为0.5mL/min，组份收集器的转速为8min/ 管，采取苯酚硫酸法，对糖进行实时检测，在490nm 下测定各个收集管的吸光度。描绘洗脱曲线，将吸收峰一样的洗脱液合并在到一起，待多糖溶液全部流入胶体，用注射器加蒸馏水至距离进水口约3cm，旋紧进水口，继续将进水口导管插入蒸馏水中。

（4）洗脱

用蒸馏水洗脱，控制液体流速5s/ 滴，洗脱3个柱床体积。

（5）再生

采用碱-酸-碱的方式去除DEAE 离子交换柱上的杂质，将填料从柱子上取出后，①置于0.5mol/L 的氢氧化钠溶液中浸泡半个小时，半小时后使用蒸馏水反复抽滤清洗，直到pH 接近7。②接着应用事先配制好的0.5mol/L 的盐酸水溶液浸泡30min，用蒸馏水反复抽滤清洗直到pH 接近7。重复①，清洗后储存于70%乙醇中。

2.3 淫羊藿多糖的测定

2.3.1 溶液的制备

配5%苯酚、0.08mg/mL 葡萄糖标准品、50μg/mL 粗多糖溶液。

2.3.2 硫酸苯酚法绘制标准曲线

将0.08mg/mL 葡萄糖标准品，分别加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6 和0.8mL 配制的葡萄糖标准品，用双蒸水补足至2mL，加入1mL 的苯酚，5mL 的浓硫酸；等到溶液冷却后，在OD490处测定其吸光度。标准曲线图以葡萄糖浓度为水平轴，490nm 处的吸光度为垂直轴绘制。

2.3.3 粗多糖中糖含量测定

取1mL 配制的50μg/mL 淫羊藿粗多糖液与1mL 双蒸水混合。向混合液中加5%的苯酚1mL后，再加浓硫酸5mL。等待溶液冷却后，在OD490 处测定吸光度，将所得的结果代入标准曲线，求得淫羊藿粗多糖中糖含量。

2.4 淫羊藿多糖中蛋白质含量的测定

2.4.1 溶液的制备

配制0.05mg/mL 牛血清白蛋白标准品液、100μg/mL 淫羊藿粗多糖溶液。

2.4.2 考马斯亮蓝法绘制蛋白质标准曲线

将0.05mg/mL 牛血清白蛋白标准品，分别加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6 和0.8mL 配制的葡萄糖标准品，用双蒸水补足至1mL，加入5mL考马斯亮蓝，在OD595 处测定吸光度。以牛血清白蛋白浓度为横坐标（X），垂直轴为595nm 处吸收（Y）的回归方程，绘制标准曲线。

2.4.3 粗多糖中蛋白含量测定

取1mL 的100μg/mL 淫羊藿粗多糖溶液加入5mL 考马斯亮蓝，在OD595 处测定吸光度。结果代入标准曲线，求得淫羊藿粗多糖中蛋白质含量。

2.5 含淫羊藿多糖的牛冻精制作

2.5.1 淫羊藿多糖稀释液制备

用超纯水配制含淫羊藿多糖浓度分别为8、4、2、0mg/mL（对照组）成 品Optidyl 稀释液（购自法国CRYO-VET 公司）各500mL。淫羊藿多糖组分EPs-1 和EPs-2 相对分子质量为81.64×103、60.53×103，本文淫羊藿多糖相对分子质量取两组分平均值71.08×103[5]。

2.5.2 牛冻精制作

西蒙塔尔种公牛精液采集、活力检测、密度测量、封装冷冻和存储严格按照《牛冷冻精液生产技术规程》（NY/T 1234—2018）的要求执行。取10 头西蒙塔尔种牛精液，称重测量体积，每份精液用移液枪均分为5 等份，分别对应2.5.1中不同多糖浓度稀释液稀释，封装冷冻后检测冻精活力和畸形率，每种浓度制作冻精数量1000支。

2.5.3 冻精质量检测

将冷冻后冻精置于40℃温水中解冻15s，剪去两端封口滴入盖玻片，400 倍显微镜下检测活力；解冻冻精用姬姆萨染色后检测，冻精畸形率。操作按《牛冷冻精液》（GB 4143—2008）的要求执行。

2.5.4 试验动物

选自武威市凉州区城西肉牛养殖合作社的300 头体重适宜、情期规律、无病适龄的母牛。

2.5.5 配种

采用同期发情技术，所有试验母牛注射25mg 氯前列腺醇钠，次日注射12.5mg，挑选发情变现明显母牛200 头，随机分为5 组。分别用淫羊藿多糖浓度为8、4、2、0mg/mL 的冻精进行配种，0mg/mL 组作为对照，输精3 个月时直肠孕检。

2.6 数据处理

试验数据使用SPSS 21 版软件分析。

3 结果

3.1 水提醇沉法提多糖

通过水提醇沉技术，从2kg 淫羊藿原材料中提取得到 255.9134g 淫羊藿粗多糖干品。255.9134g 淫羊藿多糖干品溶解在双蒸水中，用Savege 法脱蛋白去除淫羊藿多糖中的蛋白，然后用分液漏斗去除有机层，用醇沉法获得109.6112g 淫羊藿多糖。

3.2 葡萄糖标准曲线

配制0.08mg/mL 葡萄糖标准品，如表1 加入试剂，在OD490 处测定吸光度。标准曲线图以葡萄糖浓度为水平轴（X），在490nm 处的吸光度为垂直轴（Y）做回归方程，得处相关系数为0.9997、方程为y=0.0458x+0.0035的标准曲线（见图1）。

表1 多糖含量测定结果

图1 葡萄糖标准曲线

3.3 蛋白标准曲线配

制0.05mg/mL 牛血清白蛋白标准品，如表2加入试剂，在OD595 处测定吸光度。以牛血清白蛋白浓度为横坐标（X），垂直轴为595nm 处吸收（Y）的回归方程，得处相关系数为0.9971、方程为y=0.059x+0.0088 的标准曲线（见图2）。

表2 多糖含量测定结果

图2 蛋白质标准曲线

3.4 粗多糖糖含量测定

分别配制50μg/mL 醇沉后的淫羊藿粗多糖和Sevage 法去蛋白后的淫羊藿粗多糖溶液，取1mL配制的淫羊藿粗多糖母液，加入1mL 双蒸水、1mL 5%苯酚、5mL 浓硫酸，待其冷却后，在OD490 处测定吸光度。测定结果如表1，由表可以看出，醇沉后的淫羊藿粗多糖的相对质量58.86%，去蛋白后的淫羊藿粗多糖的相对质量84.12%。

3.5 粗多糖中蛋白含量测定

测定结果如表2，由表可以看出，醇沉后的淫羊藿粗多糖的相对质量7.93%，去蛋白后的淫羊藿粗多糖的相对质量14.9%。

3.6 DEAE Fast Flow 柱层析

淫羊藿多糖流色谱法快速后，用苯酚-硫酸法测定OD 值，490nm 处吸光度检测。用蒸馏水洗脱出一个峰，合并54～76 管。得到纯化的淫羊藿多糖，将收集的糖溶液冻干后，获得纯度为94.8%的淫羊藿中性多糖51.2411g。洗脱曲线如图3。

图3 DEAE 快流多糖洗脱曲线

3.7 淫羊藿多糖稀释液对精子抗冻性比较

由表3 可知，2mg/mL 与其他3 组对比精子活力明显提高，说明2mg/mL 稀释液时最适合冻精复苏，能最大限度保存精子生殖功能；4mg/mL、2mg/mL 与其他其他组对比，精子畸形率降低，表明此两种淫羊藿多糖浓度可改善畸形精子。

表3 淫羊藿多糖稀释液对精子抗冻性比较

3.8 淫羊藿多糖冻精人工授精受胎率

由表4 可知，稀释液中淫羊藿浓度为8mg/mL 时母牛受胎率最低（50.00%），其次是4mg/mL（56.67%），与对照组相比明显偏低。稀释液中淫羊藿多糖浓度为2mg/mL 时人工授精受胎率最高为80.00%；2mg/mL 浓度组冻精与对照组相比，受胎率、平均每头牛所用冻精数量为差异不大，证明牛冷冻精液稀释液中添加2mg/mL淫羊藿多糖不会对母牛受孕造成影响。

表4 人工授精对母牛受胎率

4 结论

淫羊藿多糖在配比浓度为2mg/mL 时最适合冻精复苏，能最大限度保存精子活力、顶体完整率，且对母牛人工授精不会产生负面影响，人工授精受胎率高达80.00%。