塔什库尔干羊FecB 基因非探针法高分辨率熔解曲线分型方法的研究

李 浩，郭 涛，陈 童,2，张 璐，张云生,2，郑新宝,2，阿依努尔·亚森,2*

[1.新疆畜牧科学院，新疆乌鲁木齐 830011；2.农业农村部畜禽资源（羊）评价利用重点实验室，新疆乌鲁木齐 830011；3.新疆维吾尔自治区动物卫生监督所，新疆乌鲁木齐 830026]

多胎性状是绵羊繁殖率的重要指标，多胎基因作为控制绵羊产羔数量的主效基因，发挥了重要作用。影响绵羊多胎性状的候选基因主要有骨形态发生蛋白受体-1B（BMPR-1B）、形态发生蛋白15（BMP15）、生长分化因子9（GDF9）、亲吻素（KISS-1）、骨形态发生蛋白4（BMP4）、视黄酸受体γ（RARG）、视黄醇结合蛋白4（RBP4）等。其中，BMPR-1B 基因的FecB突变型对绵羊的排卵数具有累加效应，即每增加一个拷贝将额外多排卵1.5～3.0 枚，已成为绵羊高繁殖力标记基因之一[1]。

绵羊多胎性状由多基因调控。BMPR-1B 基因的突变体FecB基因是一个常染色体基因，可通过共显性效应和部分显性效应提高排卵率，在提高绵羊排卵数和产羔数等方面发挥了重要作用。FecB基因作为绵羊多胎性状的主效基因，具有丰富的遗传多样性[2]，不同品种的绵羊广泛地存在FecB基因，可以作为选育肉用绵羊多胎类型的有效候选基因。我国的湖羊、小尾寒羊、多浪羊、策勒黑羊和巴音布鲁克羊等优良绵羊品种均携带有FecB基因，其中湖羊携带的B 等位基因频率高达0.83[3]，产羔率能达到250%，其携带的多胎FecB 基因是决定湖羊个体多胎性状的主要因素。

由于繁殖性状的遗传力普遍较低，因此，如果能确定与繁殖有关的主效基因，即可通过分子标记辅助选择将其引入育种中，从而快速将优良基因型导入育种群体[4]。通过杂交等方式将FecB基因导入繁殖力较低的羊群，以期提高绵羊群体的繁殖性能，从而提高经济效益，成为绵羊杂交改良的重要途径之一。罗生金[5]用含有BB 型的湖羊公羊与当地的哈萨克母羊进行杂交，将FecB基因导入哈萨克羊中并进行检测，初步培育出哈萨克羊多胎类型，建立了新的育种群。于振兴等[6]从湖羊上提取FecB突变利用转基因技术成功导入新疆细毛羊体内，为培育高繁殖率的新疆细毛羊奠定基础，这些研究都为众多地方绵羊品种的多胎类型（品系）选育工作提供了思路。

塔什库尔干羊主要生活于帕米尔高原3000～5000m 的东坡，是区别于其他脂臀羊的高山放牧品种，具有适应性强、抗逆性强、适宜放牧、产肉性能好等特点。但由于受高寒干旱生态环境的限制，饲养管理粗放，特别是在秋冬季节饲草短缺，严重制约着塔什库尔干羊繁殖性能的发挥，产羔率仅有105%左右。因此，建立塔什库尔干羊多胎类型（品系），提高塔什库尔干羊群体的繁殖性能，可以大幅提高养殖户的经济效益，增加农牧民收入。

绵羊的多胎类型（品系）选育离不开准确地对多胎性状进行基因检测。绵羊基因多态性检测可分为限制性片段长度多态性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）、单链构象多态性（Single-strand conformation polymorphism，SSCP）及高分辨率熔解曲线（High resolution melting analysis,HRM）等几种方法。但前两种基因检测技术普遍存在成本高、操作技术繁琐，不能满足绵羊生产中对FecB基因快速、低成本、高通量检测的需求。HRM 可以通过目的基因片段PCR 扩增之后进行产物的熔解曲线分析来区分目的片段的微小序列差异，在基因突变、单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）、甲基化和人类白细胞抗原（Human leukocyte antigen，HLA）配型等多个方面具有较大优势[7]。因此，本试验利用HRM 对塔什库尔干羊基因组中FecB基因突变位点进行分析，建立快速、高灵敏度和特异性强的基因分型方法，为塔什库尔干羊多胎新品系培育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

查阅塔什库尔干县各乡镇塔什库尔干羊产羔记录，筛选出塔什库尔干羊产双羔（多羔）母羊67 只，双羔（多羔）羔羊136 只。用ACD 抗凝采血管颈静脉采血3mL，-20℃冻存。

1.2 主要试剂及仪器

HRM 平台荧光定量PCR 仪（型号为Light Cycler 480），购自罗氏公司；血液基因组提取试剂盒（上海生工）；TaqDNA 聚合酶、10×PCR Buffer、Mgcl2（25mmol/L）、dNTP（10mmol/L）、Marker、6×DNA Loading Dye（上海生工）；引物由上海生工公司提供。

1.3 DNA 的提取

采用常规酚－氯仿抽提法提取血样中基因组DNA。利 用NanoDrop2000（Thermo Scientific，USA）测定提取DNA 样品的完整性和浓度，将所有样品的浓度调整为50ng/μL 左右。

1.4 PCR 扩增及产物检测

PCR 扩增程序：95°C预变性3min；95℃30s，55℃60s，循环数为35 次。HRM 分析程序：95℃变性5min，40°C 冷却2min；75～95℃收集荧光信号，每秒钟收集25 次信号。利用LightCycler 480 自带软件分析数据。

1.5 不同长度引物筛选

根据FecB 基因的序列（GenBank 登录号：AF357007.1），应用Oligo 软件由上海生工公司分别合成2 对引物，将引物稀释成10mmoL/L 的浓度-20℃保存。引物信息详情见表1。

表1 扩增引物序列、产物长度及退火温度

1.6 不同引物浓度的影响

对比了不同引物浓度下的HRM 分析，以确定最适合基因分型的引物浓度。引物稀释后的工作浓度为10mmol/L，详见表2。

表2 扩增引物浓度

1.7 不同镁离子浓度的影响

镁离子是影响PCR 的关键因素。通过对比不同浓度镁离子，可以确定最适合的FecB 基因分型PCR 体系中Mg2+的浓度（表3）。

表3 镁离子浓度

1.8 不同模板浓度的影响

在反应过程中不同的模板浓度与荧光染料的结合量不同，会导致信号强度差异变大，造成分型不准确。通过对不同模板浓度的影响进行HRM 分析，可以分析出最适合塔什库尔干羊FecB 基因突变分型的模板浓度。本试验采用的模板浓度分别为：500pg、5ng、50ng、500ng。

1.9 HRM 分析

每个优化的HRM 分析体系在反应过程中包括PCR 扩增阶段和HRM 分析两个阶段，其中第一阶段为40 个循环，第二阶段为1 个循环。

2 结果

2.1 PCR 扩增片段的HRM 优化结果

根据前期试验，本试验设计了115bp、140bp 2 对不同片段大小的扩增引物，PCR 扩增之后进行HRM 分析。结果表明，115bp 扩增引物聚合性以及温度的一致性较好，适合SNP 位点的分型。140bp 的效果较差，不适合塔什库尔干羊FecB 基因的SNP 位点分型。

2.2 不同引物浓度对HRM 分析的影响

通过HRM 反应后分析，结果表明，在所设的梯度中添加量太大或太小时，扩增效率较差，荧光信号提前减弱，熔解温度偏移。本试验中引物添加量为0.6μL 时扩增效率较好，可以确定为较优添加量。

2.3 不同镁离子浓度对HRM 分析的影响

通过HRM 反应后分析，结果表明，镁离子浓度在低于1.6mmol/L 或高于4mmol/L 时，扩增反应达不到平台期，扩增曲线散乱，熔解曲线中荧光信号下降。镁离子浓度在2.4～3.2mmol/L时，扩增曲线和熔解曲线聚合性较好，熔解温度差异分辨率清楚。

2.4 不同模板浓度对HRM 分析的影响

通过HRM 反应后分析，结果表明，模板浓度在设计范围内时，扩增曲线均达到了平台期。但是在500pg 以下或500ng 以上时，反应不稳定，效率较低。当反应模板浓度在50ng 时，扩增曲线、熔解曲线和熔解温度差异曲线较符合塔什库尔干羊FecB 基因分型的要求。

2.5 优化后的HRM 体系对塔什库尔干羊FecB 基因SNP 位点分型结果

利用优化后的HRM 体系对塔什库尔干羊多胎候选基因FecB进行分型分析，通过对高分辨率溶解数据进行归一化和温度平移处理得到的溶解曲线图（图1），结合溶解温度差异显示图（图2）可以清楚地区分出塔什库尔干羊FecB基因不同碱基变异的差异。检测结果表明，该基因多态性表现为一个单碱基位点突变，可以利用HRM体系实现FecB基因检测的高通量、高准确率等实际需求。

图1 熔解曲线图

图2 熔解温度差异图

2.6 塔什库尔干羊FecB 基因检测结果

由表4 可知，母羊和羔羊不携带纯合型（BB），携带杂合型（B+）母羊占31.3%，羔羊占25.7%；携带野生型的母羊占68.7%，羔羊占74.3%。

表4 塔什库尔干羊FecB 基因检测结果

3 讨论

绵羊的多胎基因FceB 被定位在第6 号染色体上，具有提高排卵和产羔的生物学作用[8]，是目前已知的绵羊高繁殖力主效基因。一些绵羊品种如湖羊、小尾寒羊等携带的多胎FecB 基因是其产羔率能达到200%、250%的主要原因。在湖羊、小尾寒羊的杂交后代群体中，均能检测到携带多胎FecB 基因的个体，其中，纯合型（BB）母羊个体产羔率可达到250%，杂合型（B+）母羊个体产羔率可达到200%。因此，通过多胎基因检测鉴定，可以区分纯合型（BB）、杂合型（B+）以及野生型的母羊个体[9]。

有研究发现含有一个FecB基因B 等位基因的母羊（B+）排卵数增多1.50～1.65 个，产羔数增加0.9～1.2 个；含有两个FecB 基因B 等位基因的母羊（BB）排卵数增多2.7～3.0 个，产羔数增加1.1～1.7 个；含有FecB 基因的母羊平均每胎产羔超过1 只，而野生型母羊产羔均为单胎[10]，这说明FecB 基因确实能够控制绵羊的多羔性状。对杜泊羊与湖羊杂交后代羊羔的FecB 基因进行检测分析后，发现随着杂交代数增加，B 等位基因频率逐渐降低，产羔率也随之降低，且与基因型相关。

塔什库尔干羊是经过长期封闭选育形成的适应高海拔、高寒条件的高原绵羊品种，但其繁殖率低，生产性能不高。由于塔什库尔干羊存在FecB基因，但双羔率较低，可以应用绵羊多胎基因检测技术和精准选配技术，选择纯合型（BB）湖羊或小尾寒羊同塔什库尔干羊杂交，在母羔出生后1月龄以内，就可采血鉴定多胎FecB基因，提前2 年完成对生产母羊个体的多胎性选留。也可以利用塔什库尔干羊携带有FecB基因杂合型（B+）的特点，实现公、母羊多胎基因杂合型（B+）的精准选配，从而大量、稳定地生产携带有多胎FecB 基因的杂交后代，组建塔什库尔干羊多胎类型核心群，提高群体产羔率30%～50%[10]，可以有效提高塔什库尔干羊养殖的生产效益。

饲养管理粗放、营养状况不佳是塔什库尔干羊双胎率低的重要原因。因此，塔什库尔干母羊在配种前要保证足够的营养供给，维持良好的体况，以此来提高母羊受胎率。在塔什库尔干羊母羊妊娠期和产羔后需要加强营养，以满足母羊妊娠及哺乳双羔的营养需要，提高羔羊成活率。

绵羊FecB基因分型多采用SSCP 和PCRRLFP 分析，HRM 是近些年兴起的用于扩增子的特异性研究的新技术。利用HRM 和PCR-RLFP对绵羊多胎主效基因FecB基因进行检测，具有准确、高效、自动化程度高等特点，可以在短时间内实现大规模群体多胎基因检测[11]。引物的不同长度、不同浓度以及不同镁离子浓度、不同模板浓度都会对HRM 分型产生影响。本研究中，最佳的HRM 分型条件为PCR 扩增片段在115bp、引物添加量为0.6μL、镁离子浓度的最佳添加量在2.4～3.2mmol/L 和反应模板浓度50ng，这与蒋立斌等[11]研究相符，能够准确地检测FecB基因突变的不同类型，满足高灵敏度、高通量、高准确性的要求。

4 结论

利用HRM 和PCR-RLFP 技术可以在塔什库尔干羊群体中检测到FecB基因，虽未发现纯合型基因，但也可以利用FecB基因检测技术对塔什库尔干羊进行早期选种，缩短世代间隔，提高选择强度，培育塔什库尔干羊多胎类型。还可以选择多胎性好的种公羊个体，通过多胎性状杂交导入，提高塔什库尔干羊群体中多胎FecB基因的比例，使群体的多羔率增加。此外，要加强母羊在配种与妊娠期间的营养和饲养管理，克服高寒高海拔生态环境的影响，提高受胎率和羔羊成活率，有效增加塔什库尔干羊的繁殖性能。