鸡传染性支气管炎病毒特异性单克隆抗体的制备与鉴定

薛 麒,侯力丹,黄小洁,秦义娴,毛娅卿,孔冬妮,王 嘉,吴华伟,刘 丹

(中国兽医药品监察所,北京100081)

鸡传染性支气管炎(Avian infectious bronchitis)是一种由鸡传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus)引起的急性高度接触性呼吸道疾病。该病常发生于鸡或火鸡,4周龄内的雏鸡最易发病,死亡率可高达90%,给养鸡业造成了巨大经济损失[1-3]。我国IBV的主要流行毒株有呼吸型和肾型,由于IBV基因易发突变等因素给该病的防控带来较大压力[4-6]。IBV血清型众多且不同血清型缺乏交叉保护,其中N 蛋白在病毒复制中起到重要作用,其编码的基因序列是IBV进化最为保守的基因[7]。IB常规的检测方法有病毒分离鉴定、血清学方法和分子生物学方法等,也是《中国兽药典》规定必须检测的外源病毒之一,通过鸡胚接种,以鸡胚死亡或感染发病作为判定依据作初步鉴定,也可用鸡检查法检测IBV的抗体[8]。单克隆抗体技术已广泛应用于禽源病毒的抗原变异分析和检测方法建立[9-10],本研究旨在采用原核表达系统表达纯化IBV N蛋白,并结合杂交瘤技术制备IBV特异性单克隆抗体,为鸡传染性支气管炎病毒的检测方法研究和生物学特性研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 质粒、毒株和实验动物 pET30a-N重组质粒,由中国兽医药品监察所构建及鉴定;IBV H120株、M41株等由中国兽医药品监察所制备和保存;8周龄BALB/c雌性小鼠,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 主要试剂 表达菌株BL21购自北京全式金公司;SDS-PAGE凝胶制备试剂盒购自上海百赛生物技术有限公司;Protein Marker、兔抗鼠IgG-HRP、一抗稀释液、膜封闭液、HRP抗体稀释液、增强型DAB显色试剂盒、TBST均购自索莱宝生物科技有限公司;其他试剂均为国产分析纯;HAT为Sigma公司产品。

1.3 N蛋白的原核表达及纯化 将重组质粒pET30a-N转化至BL21感受态细胞,挑取单克隆,接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中,于37 ℃摇床培养过夜。将上述菌液以1∶100的比例再转接含氨苄青霉素LB液体培养基培养至OD600 nm为0.6～0.8,加入IPTG诱导置37 ℃摇床200 r/min培养6 h。取诱导后的菌液进行SDS-PAGE电泳检测。

1.4 重组N蛋白的可溶性分析及纯化 将活化的菌液加到含氨苄青霉素的LB液体培养基中,培养至OD600 nm为0.6～0.8,IPTG(0.5 mM)16 ℃诱导过夜。将诱导菌液、未诱导菌液、裂解菌液上清及沉淀分别进行SDS-PAGE电泳检测。采用GST柱对重组N蛋白进行纯化。

1.5 单克隆抗体的制备 按照常规方法进行小鼠免疫、细胞融合和杂交瘤细胞筛选。将纯化后的N蛋白作为免疫原,于背部皮下多点注射免疫小鼠,每次免疫接种间隔2周,第3次免疫1周后采血,分离血清检测ELISA抗体效价,第3次免疫后2周腹腔注射免疫原加强免疫1次。3 d后融合,于融合后第10 d取细胞培养上清进行阳性克隆筛选,分别以N蛋白和His蛋白作为包被抗原,通过间接ELISA方法进行筛选,共进行3次亚克隆。

1.6 单克隆抗体的鉴定

1.6.1 单克隆抗体的亚类鉴定 取经亚克隆定株后的杂交瘤细胞培养上清,根据小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒说明书进行,测定单克隆抗体的亚类。

1.6.2 Western-blot检测杂交瘤细胞 将灭活后的IBV H120株和M41株经处理后,进行SDS-PAGE电泳分离并转至PVDF膜上;用适当稀释的杂交瘤细胞上清作为一抗于室温孵育1 h,用1∶10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗于室温孵育1 h并用增强型DAB显色试剂盒进行显色。

1.6.3 IFA方法检测杂交瘤细胞 将IBV H120株、M41株以及IBDV、ILT、EDSV和ND等常见的禽类病毒以200EID50/0.1 mL接种CEK细胞培养5 d,经甲醇固定后,以杂交瘤细胞上清作为一抗于37 ℃孵育1 h,用FITC标记的羊抗鼠IgG作为二抗于37 ℃孵育1 h,置于荧光显微镜下进行观察,以评价单抗与IBV的反应性和单克隆抗体的特异性。

2 结果与分析

2.1 pET30a-N的诱导表达 取1 mL诱导表达的pET30a-N转化至BL21的菌液进行SDS-PAGE,结果在45 kD处可见表达条带,符合预期大小(图1)。

M:蛋白分子质量标准;1:未诱导对照(pET30a-N转化至BL21);2-3:IPTG诱导(pET30a-N转化至BL21)M:Protein molecular weight Marker;1:No induced control(BL21);2-3:IPTG induced(BL21)图1 pET30a-N诱导表达Fig 1 The induced expression of pET30a-N

2.2 重组蛋白的可溶性分析 超声裂解诱导后的菌液,将菌液上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳,结果显示,pET30a-N蛋白主要出现在沉淀中,表明该蛋白以包涵体形式表达(图2)。

M:蛋白分子质量标准;1:超声后全菌;2:超声后沉淀;3:超声后上清M:Protein molecular weight Marker;1:Total bacteria after ultrasound;2:Precipitation after ultrasound;3:Ultrasound supernatant图2 pET30a-N重组蛋白可溶性分析Fig 2 Soluble analysis of pET30a-N recombinant protein

2.3 杂交瘤细胞筛选 将杂交瘤细胞培养上清用间接ELISA 方法在N蛋白和His蛋白包被板上进行ELISA抗体检测,将3次筛选均显示阳性的细胞株进行亚克隆及扩大培养定株。共筛选出3株ELISA阳性杂交瘤细胞株,分别命名为1#、18#、19#(表1)。

表1 杂交瘤细胞株的ELISA分析Tab 1 ELISA analysis of hybridoma cell lines

2.4 单克隆抗体的鉴定

2.4.1 亚类的鉴定 用ELISA方法对三株杂交瘤细胞进行鉴定,结果显示1#、18#、19#重链类型均为IgG1,轻链类型均为Kappa(表2)。

表2 ELISA法测定单克隆抗体类及亚类Tab 2 Detection of subclasses of McAbs by ELISA

2.4.2 Western-blot检测单克隆抗体 将灭活后的IBV H120株进行SDS-PAGE电泳分离,并转至PVDF膜上,用3株单抗作为一抗,进行Western-blot鉴定,结果显示3株单抗均与H120株产生特异性反应,在约52 kD大小处(N蛋白分子量)能特异性结合(图3)。

M:蛋白分子质量标准;1:1#单克隆抗体;2:18#单克隆抗体;3:19#单克隆抗体M:Protein molecular weight Marker;1:1# monoclonal antibody;2:18# monoclonal antibody;3:19# monoclonal antibody图3 Western-blot鉴定单克隆抗体Fig 3 Western-blot analysis of the monoclonal antibody

2.4.3 IFA方法检测单克隆抗体 为获得具有广谱反应性的群特异性单克隆抗体,选取18#单克隆抗体,进行IFA方法检测。结果显示单克隆抗体仅与IBV H120株、M41株发生特异性反应,出现特异性绿色荧光,而与IBDV、ILT、EDSV和ND等常见的禽类病毒均不发生反应(图4)。说明单克隆抗体的特异性良好。

3 讨 论

鸡传染性支气管炎是危害我国禽类的重大传染病之一,其病毒传染性强、变异性高、血清型和基因型复杂,感染鸡不仅会出现各种呼吸系统的症状,也会影响鸡产蛋地数量和质量,对家禽养殖业造成了严重的损失[11-13]。因此,建立有效的诊断和检测方法对于更快的发现该病有着非常重要的意义。IBV有4种结构蛋白,其中N蛋白是4种结构蛋白中唯一位于病毒内部的结构蛋白,具有高度的保守性,且N蛋白能诱导机体产生免疫应答[14-15]。此外不同IBV毒株之间N蛋白具有高度的同源性。周景明等针对IBV的N蛋白利用细胞融合法制备筛选出了8株能与所有基因型IBV结合的单克隆抗体,并对其中1株纯化与鉴定,具有良好的特异性和较高的亲和力[16]。杜旭彬等同样针对IBV的N蛋白制备并筛选出8株能与所有基因型IBV结合的单克隆抗体,单抗具有良好的广谱性[17]。但周景明等与杜旭彬等仅用ELISA方法和Western-blot方法鉴定单克隆抗体,均没有使用IFA方法鉴定单抗。IFA方法由于IBV不易适应体外细胞培养存在较大的难度。其病毒在传代细胞系上需要连续数次传代才能使其适应细胞生长,但大多数毒株可以在鸡胚原代细胞(如CEF细胞、CEK细胞)上生长,然而仅在CEK细胞上会出现典型的细胞病变[18-19]。单克隆抗体技术广泛地应用于病毒的基因、蛋白的结构和功能研究,在病毒的快速诊断和检测中发挥了重要作用,开展IBV单克隆抗体研制十分必要。

N蛋白在宿主体内产生高水平的抗体,其抗体产生时间和免疫原性均优于其他蛋白,因此,本研究对IBV H120株编码N蛋白的基因序列进行综合性二级分析及抗原性分析,选择亲水性好且抗原性较好的41-391aa区域进行后期抗原制备。利用大肠杆菌感受态细胞(BL21)表达并纯化IBV NP蛋白,多次免疫小鼠后进行细胞融合,采用ELISA方法和Western blot方法筛选出3株杂交瘤细胞株。可靠的筛选方法在制备单抗的过程中起到关键作用,ELISA方法筛选时选用表达NP蛋白和标签蛋白His作为包被抗原,进行3轮双筛选,此方法简化了筛选过程并排除标签蛋白在筛选过程中的干扰。3株单克隆抗体经Western-blot鉴定,能与常见基因型的IBV特异性结合。同时采用IFA方法检测单抗的特异性,筛选出的3株单抗均与能H120毒株、H52毒株产生IFA反应,但1#和19#不与M41、疫苗株等产生IFA反应。18#单抗能与H120毒株、H52毒株M41、疫苗株等产生IFA反应,说明其具有广谱的反应性。因此,后续可以选择群特异性单克隆抗体18#,以期为IBV IFA快速检测方法的建立打下基础。该单克隆抗体仅与IBV发生特异性反应而与NDV、IBD、AIV等禽类常见病毒均无交叉反应。本研究成功制备了IBV单克隆抗体,为下一步开展IBV诊断试剂如IFA检测试剂盒、ELISA检测试剂盒等的研制和进行IBV生物学特性研究奠定了物质基础。