一测多评法在含生物碱类成分中药质量控制中的应用研究

张 璐,龚旭昊,范 强,顾进华

(中国兽医药品监察所,北京100081)

中药质量控制和评价是制约其现代化的瓶颈之一。针对中药多成分、多功效的作用特点,有学者基于中药化学成分间存在的内在关系提出了一测多评质量评价方法[1],自提出后不断有学者对方法的适应范围、方法学验证、具体应用等进行补充完善,关于QAMS研究的技术指南已被简要概述和总结。随着色谱分析技术的迅速发展,QAMS的应用范围愈加宽泛,在药材种植、饮片炮制、工艺改进、制剂研究、新药开发等领域取得了丰硕成果。

生物碱是许多中药(Chinese medicinal materials,CMMs)的重要活性成分,其显著的药理活性和疗效已被大量研究文献和临床应用证实。中药作为复杂体系的特点决定着单一成分难以准确全面表达中药质量,多成分测定是其质量控制的有效手段和主要方向。生物碱质量控制所需的多成分同步测定方法由于对照品的供需矛盾、高昂的检测成本难以在实际生产、科研和监管领域推广应用[2]。QAMS法则可较好解决这一难题。本文通过文献研究,概述了QAMS法的理论基础,探究影响其应用的关键要素,分析可能存在的问题并展望应用前景,旨在为该方法在相关中药的质量控制应用中提供一些参考。

1 生物碱类成分及分布简介

生物碱是生物界除生物体必需的含氮化合物(如氨基酸、蛋白质和B族维生素等)外所有含氮的有机化合物,一般具有较复杂的环状结构,有似碱性质,广泛存在于毛茛科、小檗科、木兰科等双子叶植物中,在单子叶植物中少见,仅个别动物含有。中药化学成分中,生物碱是种类和数量仅次于萜类的第二大成分,采用生源结合化学结构法对生物碱进行分类,可分为鸟氨酸系、赖氨酸系等8类,其中,苯丙氨酸和酪氨酸系生物碱在中药中分布最广,色氨酸系生物碱则是生物碱中数量最多的一类,总结生物碱的类型及结构特点见表1,其在常用中药中的分布及药理活性见表2。

表1 生物碱分类及结构特点Tab 1 Classification and structural characteristics of alkaloids

表2 生物碱类成分在中药中的分布及主要药理活性Tab 2 Distribution of alkaloids in CMMs and corresponding pharmacologic activity

2 一测多评法原理

QAMS法是一种适用中药多成分质量控制的检测方法,用于对照品难得、制备成本高或不稳定的情况下同类多成分同时测定。原理是在一定的线性范围,成分的量(质量或浓度)与检测器响应成正比[11]。在多指标质量评价时,以某一典型成分(易得、廉价、有效)为内参物,建立其与其它待测成分间的相对校正因子(relative correction factor,RCF),无需其它对照品,通过RCF计算待测成分的量。

有学者归纳QAMS法为3个步骤:方法的建立、验证和应用,见图1[12],建立同时测定内参物对照品与待测成分含量的色谱法,对方法进行专属性(分离度)、线性和范围、检测限和定量限、溶液稳定性、精密度、准确度、耐用性考察,并选择合适方法计算RCF,图中所列计算方法为斜率法。综合考虑外部因素(试验环境、仪器、操作者等)、内部因素(对照品、待测成分、内参物、化学结构等)对RCF的影响,并进行验证。将求得的RCF代入公式应用于供试品计算,运用合理的方法评价实测值与计算值之间的差异[13],充分证明方法的准确性、适用性和可行性。

3 QAMS在含生物碱类成分中药控制中的应用

目前,运用QAMS进行研究的单味药及其炮制品已达二十余种。由于同一类化合物的结构相似,紫外吸收接近,因此,大部分研究集中于有相似母核的化合物,例如黄连苄基四氢异喹啉类、苦参喹诺里西啶类等;也有对不同母核的化合物的研究,例如吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱属于生物碱类化合物,吴茱萸内酯属于三萜类化合物。试验常使用高效液相色谱法,新技术如高效液相色谱四级杆飞行时间串联质谱(HPLC-QTOF-MS)法也已被引入使用。鉴于各研究的研究思路、技术路线基本相同或相似,故将所涉及单味药、化合物以及各化合物之间的RCF归纳在表3中。

表3 QAMS在含生物碱类中药成分测定中的应用Tab 3 Application of QAMS in determination of alkaloids in CMMs medicine

QAMS法在含生物碱类中药制剂中的应用与在单味药中的应用相似,选择复方中具有代表性且稳定易得的有效成分作为内参物,建立内参物与其他待测组分间的RCF,将RCF作为常数来计算待测组分的含量。QAMS在含生物碱类中药制剂质量控制研究中已经涉及到多种剂型,包括片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂、注射液等,建立QASM法对此类中药多成分进行同时定性定量分析可以更全面、科学地控制质量,提高临床用药的有效性和安全性,也更有利于中药制剂的质量控制和发展。目前,QAMS法在含生物碱类中药制剂中的应用迅速增加,是最具发展潜力的质量控制方法之一,将已开展QAMS研究的复方研究情况归纳在表4中。

表4 QAMS在含生物碱类成分的中药制剂中的应用Tab 4 Application of QAMS in traditional Chinese medicine preparations containing alkaloids

4 分析与讨论

4.1 QAMS法应用中的常见问题及解决方法 QAMS法源于内标法、校正因子法、主成分自身对照法及紫外吸收系数法,根据在一定范围内检测成分的量与检测器响应成正比的原理,利用相对保留时间(relative retention time,RRT)对色谱峰定性、相对校正因子(relative correction factor,RCF)计算待测物含量,因此待测成分色谱峰的定位、相对校正因子的计算、内参物的选择及色谱系统的适用性和稳定性等是QAMS法应用的关键。

4.1.1 如何定位待测组分色谱峰 中药成分复杂,色谱图中除待测成分色谱峰外,还存在多个其他色谱峰,因此待测成分色谱峰的正确定位是保证QAMS法准确测定的前提。虽然RRT法已经被各国药典(《美国药典》、《欧洲药典》和《中华人民共和国药典》等)和文献所采用,但由于色谱柱品牌型号繁多,即使运用同一类型填料的色谱柱也存在一些性能差异,导致计算的保留时间与实测保留时间误差较大,色谱柱耐用性不佳[53]。目前色谱峰定位方法主要有以下两种。

(1)王智民等根据保留时间提出的保留时间差法(ΔtRas)或相对保留值法(ras)[1],即采用待测成分与内参物保留时间的差值或保留时间的比值定位,目前应用较多。如谭静玲等[40]建立了一清片中4种生物碱的含量测定方法,通过考察相对保留值和保留时间差在不同品牌仪器和不同品牌色谱柱中的重复性,最终采用相对保留值法对各待测组分进行定位。刘永利等[15]考察了4种高效液相色谱系统和6种色谱柱上ΔtRas与ras的重复性,结果显示不同仪器与色谱柱对ras影响较大,不同仪器对磷酸可待因ΔtRas影响较大而对其他3种成分无明显影响,说明各成分结构不同,其影响因素各异,因此在色谱峰定位时应多考察不同因素对ΔtRas与ras产生的影响,在条件允许的情况下,尽可能选择对照品进行定位,以准确定位目标峰。

(2)孙磊等[54]提出的“双标多测法”,原理是液相色谱中化学成分在不同色谱仪和不同色谱柱上的保留时间具有线性关系。刘军玲等[55]建立双标多测法定位补骨脂中补骨脂苷等4种成分。以补骨脂苷和补骨脂素为对照,通过研发的DRS origin软件进行双标线性校正预测特征峰的保留时间,结果表明双标线性校正预测保留时间结果准确度高,显著提高了色谱峰定性的准确度和色谱柱的适用性。“双标多测法”在生物碱类成分一测多评中的应用报道较少,赵倩等[50]在进行栀子金花丸一测多评时,分别选择蒽醌类大黄素和生物碱类小檗碱进行两点校正,定位效果优于相对保留值法,提出该法应用的前提是在不同系统或色谱柱下所有待测成分保留时间回归曲线的相关性良好,即r>0.999,若再结合待测成分的紫外吸收光谱和栀子金花丸的标准图谱则会大幅提高定位的准确性。

因此,色谱峰有多种定位方法。在研究时应依据“深入浅出”的原则,充分考察每种方法应用于色谱峰定位的准确性,选择一种简单可靠方法即可。必要时,可结合化合物的紫外吸收特征、对照图谱等进行辅助确认。

4.1.2 如何计算相对校正因子(RCF) 根据一测多评法计算公式,相对校正因子要参与待测成分含量计算,因此需要获取准确度高且适用性广的相对校正因子,一般采用多点法或斜率法[56]。

多点法(average-relative correction factor,AVG-RCF)要求配制内参物和待测成分的混合对照溶液,进样不同浓度或不同体积,记录内参物与待测成分响应值,按照公式fi/s=fi/fs=(Cs×Ai)/(Ci×As)计算,得到的fi/s取平均值,即为最后计算用RCF。式中As为内参物的峰面积,Cs为内参物的浓度(或量),Ai为待测组分的峰面积,Cs为待测组分的浓度(或量)。含生物碱类成分的中药多使用多点法计算RCF。但此法容易受到待测成分浓度波动的影响,若选择参与计算的浓度点超出了线性范围,计算得到的f值带入平均值计算会导致结果产生较大偏差。为此,有学者提出线性回归方法计算RCF,即斜率法(linear regression-relative correction factor,LRG-RCF),需先建立内参物的标准曲线,并获得斜率。在标准曲线A=kc+b中,c=(A-b)/k=A/k-b/k,由于b值通常由系统或随机误差引起,若k/b值大于100时,b/k可忽略不计,则c=A/k。由于在一定线性范围内,成分含量与检测器的响应值呈正比,即:c=f×A,那么校正因子f即为内参物和待测成分标准曲线斜率比值,计算公式为fi/s≈ki/ks[57],式中ks为内参物斜率,ki为待测组分斜率。斜率法是不同浓度点拟合而成的曲线斜率的比值,避免了离群浓度点带来的计算误差。

陈俊等[58]以延胡索为研究对象,采用多点法与斜率法分别计算原阿片碱等6种成分相对于内参物延胡索乙素的RCF,计算得到的7种成分含量与外标法结果进行Pearson相关性分析,结果表明:外标法与两种一测多评法之间的相关系数均大于0.999,说明外标法和两种一测多评法测得结果相似性极高。同时经方差分析,P值远大于0.05,说明三种方法计算结果无显著性差异。

4.1.3 如何选择内参物 从表3、表4所列的内参物和检测成分来看,选择的检测成分是公认的与药材(成药)临床功效具有相关性的指标成分或专属成分,选择的内参物还应具备性质稳定、对照品来源有保障、价廉易得等特性以体现QAMS法简便、易操作、低成本的特点,《中国药典》黄连药材标准项下小檗碱、表小檗碱、黄连碱、巴马汀的含量测定方法即为QAMS研究的典型实例[59]。赵倩等[50]选择栀子金花丸QAMS内参物时,黄芩苷、小檗碱、大黄素均符合内参物要求,但在进行相对校正因子耐用性考察时发现,以小檗碱或黄芩苷为内参物时,某些成分的相对校正因子波动较大,以大黄素为内参物时,各成分间的相对校正因子较稳定。提示进行内参物选择时,还需分别建立与其他成分间的RCF并考察其重复性,必要时用外标法实测值对QAMS法结果进行验证,选择偏差最小的QAMS模型作为该中药的质量评价方法。若无满足上述条件的化学成分,可以添加同类型结构的化合物作为内参物。如孙菡[15]等加入同为异喹啉型生物碱的盐酸小檗碱为内标,分别建立盐酸吐根碱、盐酸吐根酚碱的相对校正因子,从而计算药材及制剂中两种成分的量。

4.1.4如何评价QAMS法结果 QAMS质量评价模式能否准确应用于生物碱类成分含量测定关键在于计算结果的可靠程度。基于当前生物碱QAMS研究实例,多用外标法实测值与QAMS推算值进行比较。采用的比较方法主要有直接计算两者偏差法、Pearson相关性分析、配对t检验等,其中计算两者之间偏差应用较多。QAMS法推算值与外标法实测值之间没有显著性差异,说明建立的RCF有良好的重现性和准确性,在缺乏对照品的情况下,可以用QAMS法对生物碱类成分含量进行同步测定。

4.2 影响QAMS法准确性的关键因素

4.2.1 建立良好的色谱系统 在QAMS重现性考察中,不同实验室研究人员采用不同的分析仪器系统进行检测,间接考察了流动相组成、色谱柱、柱温、流速等因素对RCF的影响。其中,流动相组成可显著影响色谱峰的分离度和峰参数,若引起RCF偏差,需要优化色谱条件进行调整。程中琴等[18]首次提出对色谱系统进行定量分析,对色谱条件进行了多方面的考察,包括色谱柱、柱温、流动相系统组成、流动相pH,选取各组分对称因子、峰宽、分离度平均值为评价指标,根据各参数对色谱图评价的影响,分别赋予权重0.35、0.30、0.35,计算综合评分(综合评分=T/Tmax×0.35—W/Wmax×0.30+R/Rmax×0.35),通过比较各色谱图综合评分,优选QAMS测定的色谱条件。

4.2.2 选择适宜的检测波长 目前,生物碱QAMS研究中常用的检测器为紫外检测器,对无紫外系数或紫外吸收弱的化合物,使用ELSD蒸发光散射检测器作补充,例如徐彦等[34]采用HPLC-ELSD建立了卷叶贝母的“一测多评”法,同时测定其中贝母乙素和贝母甲素。对于紫外检测器,根据待测物的结构特征选择合适的检测波长至关重要,若无法兼顾各组分选用最佳波长,会降低各组分的定量限,影响含量测定。检测波长的选择有以下三种情况,一是选择共有最大吸收波长区,如栀子金花丸待测成分中,小檗碱和4个黄芩黄酮类成分在254 nm波长附近有明显吸收,内参物大黄素及其他4个大黄蒽醌类成分在254 nm波长处为特征吸收,在此波长下,供试品溶液中各待测成分色谱峰分离度良好,且峰纯度检查符合含量测定要求。因此,选择了254 nm作为检测波长[50]。二是综合选择峰数量多且基线稳定的波长。如黄柏中黄柏碱、木兰花碱与巴马汀、药根碱、小檗碱母核结构不同,最大吸收波长不一致。对5种成分进行紫外吸收光谱并结合3D图谱分析,选择了5种成分都有较好吸收的波长作为检测波长,虽然每个成分都不能实现最优的波长检测,但在一定含有量范围仍然可以实现较为准确的定量[16]。三是在梯度洗脱过程中实现可变波长检测。通过设置洗脱条件,根据待测成分的最大吸收波长分别选择相应的检测波长。如栀子中栀子苷和西红花酸类衍生物为不同类别的化合物,前20 min选择栀子苷的最大吸收238 nm,后20 min选择西红花酸类最大吸收440 nm[60]。

4.2.3 确保对照品的纯度准确 同类成分结构及其相似(母核相同,取代基有微小差异)的同系物之间最大紫外吸收相近,RCF理论上应该接近于1[61],但表3、表4中反映某些实际测定值却偏离1,因对照品纯度不准确造成RCF严重偏离现象需要引起关注。许多生物碱类对照品价格昂贵不易获得,所使用的单体成分尽管已经进行结构鉴定和纯度检查,但未进行严格的纯度标定,纯度值或高或低,对实验结果影响较大。建议尽可能采用原理不同的定值方法相互佐证,确保标定的纯度结果准确。

4.2.4 科学进行样品的前处理 样品的前处理对成功分析药品质量起关键作用。尤其在QAMS应用中,若某个有效成分本身含量较低,又不能被完全提取,检测的浓度值过低,则极易受实验仪器、检测波长、对照品的纯度等参数影响导致低于检测限灵敏度、超出线性范围或RCF值不准确。生物碱类成分可应用酸提碱沉法提取分离,如斑花黄堇药材中生物碱成分用碱沉后调节pH,用不同有机溶剂萃取,用紫外分光光度计在波长200～550 nm处扫描紫外吸收情况,根据吸收峰数量和吸光度大小确定提取方法[14]。梁颖欣等[25]在钩藤生物碱的提取试验中,通过考察不同聚酰胺加入量对各生物碱类成分吸附损失和去除鞣质的程度来确定供试品溶液的制备方法。有研究提示,由于大多数生物碱在植物中以成盐形式存在,用氨水浸润后可使其游离而溶于有机试剂。因此,在提取生物碱时加入少量氨水可增加生物碱的溶出[58]。

5 意义及展望

QAMS法是利用一个对照品来实现对多个成分的同步测定,不仅可以节约成本,还能够更加全面控制中药质量,可有效缓解对照品供应不足与多指标定量评价之间的矛盾,已广泛应用于中药材、中药饮片、中药提取物、中成药等多种中药领域。除生物碱外,QAMS法目前已经实现了中药复杂体系中黄酮类、酚类酸、皂苷类、木脂素类、蒽醌类等多种成分的同时定量分析。检测范围也从结构相似的同类成分扩展到不同结构母核的化学成分。

RCF的准确性是影响QAMS法准确应用的关键参数。未来在试验设计阶段就应充分考察不同因素对RCF的影响,例如环境因素(检测时间、检测人员、仪器设备、色谱柱)、操作参数(流动相组成、检测波长、色谱柱长度、进样体积、色谱柱温度、对照品浓度)、峰检测参数(不同狭缝宽度、谱带宽、积分参数)等,原则上不少于3家实验室间进行验证,以建立相对稳定、重现性好的RCF,并根据实际情况制定RCF的可接受范围和应用条件。在目标分子有较好分离度的前提下,RCF应具有广泛的适用性,可同时适用于不同剂型的成药和药材的多成分定量评价。随着研究数据不断集成,可考虑优选经典应用实例建立QAMS—RCF数据库,收录各类成分的色谱条件及成分间RCF值,实现数据、方法共享,节约试验成本,为更多中药材和成药的质量控制及评价提供可靠参考,推动建立更完善的中药质量控制体系,实现中药的传承创新发展。