猪瘟病毒致弱机制研究进展

陈紫昱,徐 璐,夏应菊,宋新宇,刘业兵

(中国兽医药品监察所国家猪瘟参考实验室,北京 100081)

猪瘟(Classical Swine Fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)引起的猪最重要的传染病之一,给全球养猪业带来了巨大的经济损失,是世界动物卫生组织规定的必须上报的猪病之一,我国2022年将其调整为二类动物疫病。CSFV属于黄病毒科瘟病毒属,为二十面体的囊膜病毒,具有约12.3kb的单股正链RNA基因组。其基因组包含一个开放阅读框(ORF),5’端和3’端各有一个非编码区(UTR)。病毒颗粒由4种结构蛋白(核心蛋白C、包膜糖蛋白Erns、E1和E2)以及8种非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)组成[1]。针对CSF的防控,由强毒株致弱制成的减毒活疫苗是应用最为广泛的。弱毒疫苗Thiverval株是OIE推荐的疫苗,该疫苗株是从原始强毒Alfort毒株衍生的减毒疫苗株,具有可靠的保护效力和快速的保护能力。除此之外,还有日本的减毒疫苗株GPE菌株,GPE菌株是由高毒性菌株ALD先在猪睾丸细胞中的142次传代、在牛睾丸细胞中的36次传代和在原代豚鼠肾(pGPK)细胞中的32次传代获得的,该疫苗株使得日本在20世纪免受CSF的困扰。菲律宾的Lapinized Philippines Coronel(LPC)疫苗也是一种减毒的CSFV毒株,是预防和控制CSFV感染的重要工具,在CSF流行区广泛使用。20世纪五十年代,中国科学家经过兔体连续传代和系统测试,培育出了一株适应于家兔的 CSFV兔化弱毒株(Hog Cholera Lapinized Virus,HCLV)。猪体试验表明该毒株不仅对猪安全,还保持了优良的免疫原性。用该毒株免疫猪 4 天即可产生免疫保护力,一次接种产生的免疫保护期可达一年以上。该毒株于1956年用于生产弱毒疫苗,并在全国推广使用。同年,中国政府将该毒株以先进科技成果先后无偿赠送给前苏联、匈牙利、罗马尼亚、朝鲜、保加利亚及越南等当时的社会主义友好国家。匈牙利应用证明,来自北京的兔化弱毒株优于美英当时的Rovac及SFV等商品弱毒苗,它对种猪、乳猪无残余毒力。HCLV种毒之后被传到大部分欧洲国家及一些拉美国家,并且该疫苗荣获 1983 年国家发明一等奖。时至今日这一毒株仍在我国和世界上许多国家广泛使用,是国际上公认最安全有效的猪瘟弱毒疫苗,因此国际上通常将该疫苗株称为“C”株,即“中国”株。有研究表明,CSFV通过兔体传代,导致E2基因关键氨基酸位点突变,促进猪瘟病毒侵入家兔脾脏淋巴细胞,进而赋予CSFV对家兔的适应性[2]。猪瘟兔化弱毒疫苗应用已有多年的历史,但其毒力致弱的分子机制还尚未完全明确。并且目前使用的减毒活疫苗会干扰血清学诊断,使得鉴别诊断存在困难,因此继续研发新的诊断工具和新型疫苗十分必要。随着分子生物学技术的发展,对CSFV的毒力基因有了更为深入的研究。本文从病毒结构角度对CSFV致弱机制的国内外研究成果进行综述,以期为后续的研究以及候选疫苗的开发提供参考。

1 基于结构蛋白E2的致弱机制研究

E2蛋白位于病毒囊膜表面,是一种功能重要的糖蛋白,分子量大小约为55kDa,其空间结构由三个疏水区和三个氨基端的链内二硫键构成。在靠近E2蛋白氨基端上游有一段信号肽序列,羧基端有一段跨膜区,E2蛋白由A、B、C、D四个抗原结构域组成(图1)。E2蛋白是CSFV毒力的决定因子之一,也是免疫原性最好的结构蛋白,能诱导中和抗体的产生[3]。

图1 图1 E2蛋白基因结构图Fig 1 The structure diagram of E2 protein

早在2005年,Risatti等用疫苗株E2基因替换强毒株中的E2基因,构建的嵌合病毒在猪体内的毒力明显降低,从而证明E2基因与毒力致弱直接相关。更加深入的研究发现,E2蛋白羧基端882-1032之间存在一段12个氨基酸的取代(T886M、P889L、Q892R、S927L、T928A、H955R、D958G、A975E、R979S、A988T、R994K和I1032V)可以降低病毒致病性[4]。研究表明,与C株同为1.1亚型的经典强毒株石门株在E2基因上存在差异位点,这一结果提示E2基因可能是导致C株致弱的原因之一。E2蛋白与宿主蛋白DCTN6之间的相互作用也可以影响病毒毒力,介导与DCTN6相互作用的关键E2位点突变后的重组突变体E2ΔcDCTN6v在猪中被完全减毒[5]。E2蛋白与核糖体蛋白的相互作用也会影响病毒毒力,敲除核糖体蛋白RPLP1基因可以使病毒滴度降低[6]。E2蛋白的糖基化位点是影响CSFV毒力的重要因素,研究发现C株E2蛋白在序列基序986 NYT988位点有独特的糖基化,这可能是C株毒力减弱和提供完全保护的原因[7]。

E2糖蛋白对CSFV的免疫原性同样有着十分重要的作用,它不仅可以诱导抗体的产生,而且也是诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的主要蛋白。基于E2蛋白的免疫原性,将E2蛋白和CD154抗原结合制成的改良疫苗具有良好的保护效力[8],并且国内外也有商品化的猪瘟E2蛋白亚单位疫苗上市。最近的研究表明,E2蛋白CD结构域边界鉴定出新的线性表位P33,具有中和活性并且可用于CSFV与牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhoea virus,BVDV)的鉴别诊断[9],但其对病毒致弱的作用有待进一步的探究。

E2蛋白和CSFV的其他区域存在相互作用,共同调控CSFV的感染过程。孙永科等[10]利用构建重组腺病毒的方法,对不同处理组的猪进行了观察,发现E2和Erns结合的重组病毒可以对猪只提供保护。仇华吉等[11]研究发现表达C株Erns-E1-E2、Erns-E2或E1-E2的嵌合病毒,在兔子脾脏中可检测到与C株相类似的病毒复制水平,这表明E2蛋白和Erns或E1协同作用很有可能是C株致弱的原因之一。更加深入的研究显示,E2结构域I中的氨基酸P108和T109对于C株在家兔体内的致弱是关键的[2]。最近的研究表明,用石门株中的Erns或E2替代C株的相应部位构建的嵌合体病毒诱导轻度的发热反应,而E2和Erns均被替换的嵌合体病毒则消除了发热反应并且在兔体内没有表现出适应性[12],这同样表明E2蛋白和Erns之间的相互作用是C株在家兔体内致弱的关键。E2蛋白和3’UTR在减毒嵌合体病毒基因组的稳定性方面表现出协同作用,E2或3’UTR的替代均可降低病毒的复制。E2蛋白是目前研究最为广泛的蛋白,对E2蛋白关键位点的综述,将为研制新型疫苗和诊断制剂提供理论基础。深入研究E2蛋白与病毒致弱的关键位点,有利于通过精准的基因编辑来实现新的标记疫苗的研发。

2 基于结构蛋白Erns的致弱机制研究

Erns是分子量为44kDa的囊膜糖蛋白,由227个氨基酸组成,共有7个糖基化位点。Erns通常以二聚体形式存在,是CSFV毒力的必需因子。Erns也能够刺激中和抗体的产生,但是单独的Erns不能诱导保护性免疫反应,需要和E2蛋白共同存在[3]。

Erns对病毒的毒力有十分重要的意义,缺失Erns蛋白的糖基化位点能使病毒毒力减弱。Borca等[13]基于Brescia Erns基因构建了一组糖基化突变体,发现N269糖基化位点使病毒毒力减弱,这表明Erns与CSFV毒力致弱直接相关。Tucakov等[14]的研究发现缺乏半胱氨酸171的CSFV突变体影响了Erns二聚体的形成从而在猪体内被减弱;体内自发补偿突变使Erns二聚体恢复后CSFV恢复了毒力,这证实了Erns二聚体的形成对CSFV毒力的重要性。Erns还具有细胞毒性作用,它可以抑制淋巴细胞的增殖和蛋白质的合成,并且尚未发现其细胞毒性作用具有种属特异性,这种细胞毒性作用有可能是Erns与毒力相关的另一原因。Erns对CSFV毒力的影响可能是因为它具有核糖核酸酶(RNase)活性,而RNase具有神经毒性、免疫抑制、抗蠕虫和抗肿瘤等作用。王苗苗等[15]构建了一株基于低毒力野生型CSFV的缺乏RNase活性的cDNA克隆,Erns的RNase活性的缺失增强了仔猪体液免疫反应,降低了病毒的毒力、传染性和持久性。与RNase活性有关的关键氨基酸位点被取代后,CSFV的致病性减弱或丧失。Iqbal等[16]研究发现,对CSFV和BVDV的Erns基因进行修饰,使其丧失RNase活性后病毒致病性减弱,这表明RNase活性与毒力致弱直接相关。RNase活性还可以阻止ssRNA、dsRNA诱导的干扰素(IFN)表达,在自然界发现的任何瘟病毒表达的Erns几乎都是IFN的拮抗剂[17],影响RNase活性的突变(H30F、PR突变)会显著减弱病毒对IFN表达的抑制作用[18]。Python等[19]构建了无RNase活性的CSFV突变体,结果显示,无RNase活性的突变体诱导的IFN-α含量是野生型CSFV诱导的10倍。而逃避IFN反应很有可能是CSFV诱导持续性感染的核心因素[20],已有研究表明C株疫苗在接种的早期缓慢复制,避免了IFN-α和IFN-β的过早过度表达,这种抑制IFN产生的特性可能是C株致弱的机制,这也表明Erns影响毒力的机制可能是其RNase活性对IFN表达的调控。Erns蛋白是决定病毒毒力的重要因素,更好的了解Erns与病毒复制以及病毒毒力的关系为开发针对CSFV的DIVA疫苗提供了新的研究方向,从而有利于区分CSF与其他瘟疫病毒,并为有效控制和根除CSF做出贡献。

3 基于非结构蛋白的致弱机制研究

CSFV病毒颗粒包含8种非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B),这些非结构蛋白在CSFV感染过程中发挥着各自的作用。Npro是CSFV特有的一种半胱氨酸样蛋白,它可以从正在翻译的多聚蛋白上断裂并成熟,其分子量约为19kDa。Npro有可能与病毒毒力相关,Mayer等[21]构建了缺失Npro基因的突变体,发现中等毒力和强毒株突变体都导致毒力的减弱,这表明Npro与病毒毒力致弱相关。研究发现,Npro蛋白可以抑制宿主的免疫应答,Npro既可以拮抗dsRNA介导的TRL3依赖和非依赖性途径中Ⅰ型IFN的诱导,又可以通过降解TRL3的蛋白酶体抑制I型IFN的诱导[22],同时还可以通过抑制干扰素调节因子(IRF1)的表达来抑制Ⅲ型IFN的产生[23]。Npro蛋白很有可能参与细胞蛋白的泛素化修饰,抑制细胞增殖,诱导I型辅助性T淋巴细胞的凋亡。Npro还可以拮抗TRL3和视黄酸诱导基因蛋白Ⅰ(RIG1)介导的细胞凋亡,从而使病毒不易被清除,这可能是CSFV免疫逃避的一种机制[24],这种拮抗宿主对CSFV入侵的反应是否是Npro影响毒力的原因还有待更加深入的研究。Npro与核糖体蛋白S20(U10)的相互作用可以阻止CSFV在体内的复制,并且在CSFV感染过程中发挥抗病毒作用[25],然而S20降低病毒在体内含量的机制尚不明确。Npro蛋白对病毒复制以及宿主免疫应答的作用可能是缺失Npro基因的突变体毒力致弱的原因之一,但更深入的机制还值得更进一步的研究。

P7蛋白是一种分子量约为6kDa～7kDa的疏水性小跨膜蛋白,在CSFV毒力中起着重要作用。Gladue等[26]通过丙氨酸扫描突变创建了一组在P7基因上含有3～6个连续氨基酸残基替换的重组突变体,研究了接种动物的临床症状和体内病毒滴度,发现P7蛋白与病毒毒力致弱直接相关。林志等[27]利用质粒pEGFP-p7转染巨噬细胞,对IL-1β的mRNA蛋白含量进行监测,发现P7可以诱导巨噬细胞分泌IL-1β,这表明P7蛋白参与CSFV在体内介导的炎症反应,但其与病毒致弱的关系有待进一步的研究。赵成等[28]的研究结果显示,P7蛋白TM1区的3个氨基酸取代(p7TDI18/19/20AAA,p7EVV21/22/23AAA和p7YFY25/26/30AAA)抑制了感染性病毒的产生,病毒滴度显著降低。P7可以与宿主蛋白CAMLG相互作用,破坏这种作用会影响CSFV在细胞培养中复制的能力[29],这为病毒毒力致弱机制的研究提供了一定的参考。

NS3蛋白在CSFV的复制、转录和翻译以及病毒多聚蛋白的加工过程中起到重要作用[30]。朱洪昌等[31]用丙氨酸或天冬氨酸单取代或全部取代NS3蛋白上保守的四个碱性氨基酸残基以破坏NS3蛋白上保守的带正电荷的区域,结果显示突变体VH24A、VR50A、VH24D、VR50D或VK74D的病毒滴度显著降低,这表明 NS3是病毒致弱的潜在靶点。邓少峰等[30]研究发现宿主蛋白PSMB10通过泛素-蛋白酶体途径刺激NS3蛋白降解来抑制CSFV增殖。李小蒙[32]等发现肿瘤坏死因子受体相关因子5(TRAF5)与NS3相互作用,TRAF5通过激活p38 MAPK通路促进CSFV复制。NS3与病毒复制密切相关,然而关于是否可以突变NS3抑制病毒复制,从而降低病毒滴度,导致病毒对猪体毒力下降的研究还需深入的探索。

非结构蛋白NS4A、NS4B、NS5A、NS5B通常与病毒复制与合成相关,影响病毒复制的位点是影响毒力的潜在位点。病毒在猪体内复制效率下降,可能会导致病毒滴度降低．从而导致病毒对猪体的毒力下降．成为对猪体不产生致病效应的减毒株[33]。马立新等[34]研究发现CSFV的NS4A蛋白是一种抑制哺乳动物细胞中RNA干扰(RNAi)的新RNA沉默病毒抑制因子(VSR),VSR作用可以帮助CSFV逃避宿主的抗病毒作用,VSR缺陷型CSFV的复制被减弱,这为开发减毒活疫苗提供了依据。张彦明等[35]证明NS4A蛋白可以通过增强MAVS途径诱导IL-8产生,并促进CSFV复制。NS4B蛋白可以与宿主的核糖体蛋白RPLP1相互作用,通过促进病毒基因组的转译增加病毒产量[36]。曹志等[37]研究表明,NS4B的表达可以显著抑制TRIF、IRF3和NF-κB p65的表达,从而抑制poly (I:C)刺激后IFN-β和IL-6的分泌,影响TLR介导的先天免疫应答。张彦明等[38]利用慢病毒介导的组成型过表达和真核质粒瞬时过表达方法,对Rab5敲除后细胞中病毒RNA含量进行了研究,结果表明,敲除Rab5对CSFV产生有抑制作用,并且参与NS4B复合物的形成。非结构蛋白NS5B是一种RNA依赖的RNA聚合酶,CSFV NS5B的162位点的氨基酸残基由脯氨酸突变为苏氨酸,可以增加RNA依赖RNA聚合酶(RdRP)活性,促进CSFV基因组的复制[39]。非结构蛋白NS5A在低浓度时可以与NS5B结合形成复制复合体,促进病毒RNA的合成;当NS5A的浓度超过NS5B时,NS5A可以与NS5B和3’UTR相互作用,抑制病毒的复制[40],这可能是NS5A通过浓度变化调控病毒复制的原因。肖明等[41]利用谷胱甘肽S-转移酶下拉试验和免疫沉淀分析表明位于NS5A末端的的氨基酸K399、T401、E406和L413对NS5A-NS5B相互作用是必需的,这种相互作用可能是NS5B蛋白和NS5A蛋白对核糖体内部位点介导(IRES)的翻译产生影响的机制。

综上所述,非结构蛋白对病毒毒力和病毒生命周期至关重要。我们可以更加全面地了解非结构蛋白对病毒感染的作用,以便更深入地研究这些蛋白中负责病毒毒力的专门区域,有助于设计更有效的生物工具来控制CSF的发生。

4 基于3’UTR的致弱机制研究

CSFV的3’非编码区(3’UTR)是一个富含AU的区域,该区域也与病毒的毒力相关。王毅等[33]发现在C株的3’UTR中存在12个碱基序列(CUUUUUUCUUUU)的插入,这是导致中国猪瘟兔化弱毒疫苗减毒的关键因素。低毒力的经典猪瘟病毒Pinar del3’UTR中发现了一段平均长度为36个尿苷的新型聚尿苷束(poly-U),这可能是病毒毒力衰减的原因[42]。在减毒活疫苗Thiverval 3’UTR的233～259 bp之间,存在着一段6-32nt的可变长度的富T序列,推测该插入是Thiverval毒力衰减的原因之一[43]。王苗苗等[44]在最近的研究中也发现在3’端插入poly-U可以导致病毒衰减,减少受感染仔猪排毒量,降低CSFV在体内的复制水平和疾病的严重程度。据报道,CSFV 3’UTR的3342位点的脯氨酸仅存在于兔化减毒株中,包括C株、Riems、LPC和HCLV-India株,这表明3342位点的脯氨酸可能是病毒在兔体内致弱的原因之一[39]。3’UTR还可以与Erns的RNase功能协同作用来调节宿主的先天性和适应性免疫应答,从而有利于CSFV在靶组织中的复制[45]。上述研究表明,3’UTR有着十分广阔的研究前景,可以通过对3’UTR进行不同的修饰从而研究病毒毒力的变化,从而进一步揭示影响病毒致病力的分子机制。

5 小结与展望

近年来,随着分子生物学等技术手段的发展,有关CSFV致弱机制的研究得到了极大的发展。CSFV的结构蛋白、非结构蛋白以及3’UTR对病毒致弱有着不同程度的影响。E2蛋白是病毒毒力的决定因子之一,也是免疫原性最好的结构蛋白。Erns蛋白是毒力的必需因子,通常和E2蛋白协同作用共同调节病毒毒力。非结构蛋白Npro可以调节病毒毒力,而NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B则通常在病毒复制过程中发挥作用。3’UTR通过碱基修饰可以使病毒致弱。上述研究成果均提示我们,猪瘟病毒的致弱机制非常的复杂,任何病毒基因的变化可能都会影响病毒的毒力,因此,对猪瘟病毒致弱毒株的研究和开发是一个系统的工程。现有的猪瘟弱毒疫苗虽然具有良好的保护性和有效性,但仍然面临着新的病毒突变体和不能进行鉴别诊断的挑战。本文综述了CSFV可能存在的致弱机制,这些研究启发未来新型标记疫苗的研发可以通过对CSFV结构蛋白和非结构蛋白的关键位点的基因修饰来实现,同时也为抗病毒药物的开发提供新的研究思路。