中药重楼活性成分与药理作用机制研究※

●张明洋 刘 芳 陈 川 余 桉 张蓬阳 刘忠涛 刘 莹

（长春科技学院 吉林 长春 130600）

重楼又名草河车、枝花头等，临床常用主要来源于重楼属植物七叶一枝花和云南重楼的根茎中，在我国云南、贵州等地分布较多，是中药组方清热解毒通淋汤的重要成分[1]。具有清热解毒、抗肿瘤、消炎镇静、止血化淤的功效，现已从本属植物中分离鉴定出甾体皂苷、黄酮类化合物、脂肪酸酯类化合物等50余种，其中甾体皂苷、黄酮类化合物占总化合物的80%[2-3]近年来重楼药用价值逐渐受到临床重视，为更好开发利用重楼属植物资源，本文对其化学成分及其活性作用进行分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

重楼中药材（干货，购于淘治大药房 ）；来自（长春科技学院微生物实验室）的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌；无水乙醇；大孔树脂（HPD-100）；芦丁标准品；DPPH；FeSO4；H2O2；水杨酸；邻苯三酚；Tris。

1.2 设备

中药粉碎机、微波炉、HL-2型恒流泵；自动部分收集器；摇床。

1.3 试验方法

1.3.1 重楼粗提物制备 重楼粉碎，过筛（20目），密封储存。取重楼粉20 g，用0·2 L 70%乙醇浸泡4 h后，200 W微波下提取230 s，将提取液过滤，蒸发得到重楼粗提物浸膏。

1.3.2 重楼黄酮的纯化 将购买的HPD-100大孔树脂装柱，装柱前先在乙醇溶液中浸泡12 h，使HPD-100溶胀，次日装柱，乙醇冲至流出液无混浊产生，用H2O冲至没有乙醇味即可。在色谱柱上端加入粗提液。静态，吸附4 h，然后用30%乙醇（3BV）进行洗脱，收集洗脱液，浓缩，干燥得皂苷精提物，记为HPD-a。接着用40%乙醇（3BV）进行洗脱，得到的提取物记为HPD-b。最后用50%乙醇（3BV）洗脱，得到的提取物记为HPD-c，以芦丁为标准品依次测得其含量。

1.3.3 重楼抑菌能力的验证

1.3.3.1 抑菌圈试验 取重楼粗提物10 mg，加蒸馏水10 mL溶解，配以10 mg/mL的重楼粗提液，经微孔滤膜（0·45 μm）过滤、去渣，制成抗菌实验用待测液。将培养基倒入平板。静等20 min，无菌条件下取每种细菌悬浮液100 μL，缓慢加入平板。菌液注入后将其涂匀。此时平板内铺满对应的菌液。将滤纸浸泡在抗菌实验待测液中，用镊子夹住滤纸，并将其放在含细菌的平板上。每组平行测试2次，培养温度为37℃。24 h后，比较抑菌圈大小。

1.3.3.2 最小抑菌浓度（MIC）的确定 取重楼粗提物0·1 g溶于10 mL蒸馏水，得重楼粗提取液待用。按比例进行稀释，然后对重楼粗提物进行MIC的测定，其中，空白对照组选择蒸馏水，阳性对照选择0·1 mg/mL青霉素溶液。判定标准：观察待测组试管的浑浊度，前提是空白对照试管出现浑浊，阳性管呈透明状态的。

1.3.4 重楼抗氧化能力的验证

1.3.4.1 清除羟自由基（·OH）的活性研究 参考张正旭等[4]的方法，先配制6 mmol/L硫酸亚铁溶液，再将30% H2O2配制成8·8 mmol/L溶液，以上均为现配。将无水乙醇作为溶剂配制成6 mmol/L水杨酸乙醇溶液。表1的内容进行具体试验。得到的吸光值代入公式，即可得到清除率。选取Vc作为阳性对照，对照品和每个样品配制5个不同的浓度，每个浓度做3次平行实验。

表1 OH自由基清除能力反应系统

清除率=[（A-C）-（B-D）]/（A-C）×100%

1.3.4.2 清除超氧阴离子的活性研究 参考冯娇等[5]的方法并加以改进，配制好0·05 mol/L，pH8·2，Tris-HCl缓冲液，配制2·5 mmol/L邻苯三酚，10 mol/L的浓盐酸及不同浓度的待测样品。根据表2的内容进行试验。得到的吸光值代入公式，即可得到清除率。选取Vc作为阳性对照，对照品和每个样品设置5个不同的浓度，进行3次平行实验。超氧阴离子清除率=（A0-A1）/A0× 100%式中，A1 为加入样品的反应液吸光值，A0 为用Tris-HCl 缓冲液代替样品的反应液吸光值。

表2 超氧阴离子清除能力反应系统

1.4.4.3 DPPH自由基的清除力测定 参考马泽刚等[6]的方法并加以改进，以95%乙醇溶解DPPH粉末，配制得到0·002% DPPH溶液，避光保存。将样品依次稀释成不同的浓度梯度。根据表3的内容进行实验。得到的吸光值代入公式，即可得到清除率。选取Vc作为阳性对照，对照品和每个样品设置5个不同的浓度，进行3次平行实验。清除率=［A空-（A样-A对）］/A空×100%

表3 DPPH清除能力反应体系

2 结果与分析

2.1 重楼黄酮的纯化

采用不同浓度乙醇试剂对重楼粗提液进行梯度洗脱，收集洗脱液合并浓缩，烘干备用，标注为HPD-a、HPD-b、HPD-c。其提取率分别为0·98%、2·13%、1·74%。

2.2 重楼抑菌效果分析

2.2.1 抑菌圈试验 如表4所示，重楼粗提液对金黄色葡萄球菌有良好的抑菌效果，对表皮葡萄球菌，大肠杆菌有一定的抑菌作用，但效果不明显。

表4 抑菌圈实验结果

2.2.2 最低抑菌浓度的测定

由表5可知，重楼粗提液对大肠杆菌的抑菌作用在三种常见细菌中表现一般，在浓度为5 mg/mL时，表现为抑菌作用；如要对表皮葡萄球菌有抑制作用，则浓度需达到为1·25 mg/mL。当粗提液浓度为0·625 mg/mL时，就可以对金黄色葡萄球菌产生抑制作用。

表5 最低抑菌浓度测定

2.3 重楼黄酮的抗氧化结果分析

2.3.1 羟自由基（·OH）清除能力比较 重楼粗提物、纯化后的重楼黄酮组分都具有一定的羟自由基（·OH）清除作用；在浓度为8 mg/mL时重楼粗提物的清除效果和重楼黄酮组分HPD-b相当。重楼黄酮组分HPD-b清除率可达68·5%。

图1 羟自由基（·OH）清除能力比较

2.3.2 超氧阴离子清除能力比较 重楼粗提物、黄酮组分HPD-b均对超氧阴离子有较好的清除能力，而重楼黄酮组分HPD-c、HPD-a虽然效果没有上述两个组分好，但当浓度达到3 mg/mL时，也有超过50%的清除率。

图2 超氧阴离子清除能力比较

2.3.3 DPPH自由基清除能力比较 重楼粗提物、纯化后的重楼黄酮组分都具有一定的DPPH自由基清除能力，在浓度为4 mg/mL时，黄酮组分HPD-b对DPPH自由基的清除率可达65·78%，在此浓度下，清除率大小为Vc＞HPD-b＞粗提物＞HPD-c＞HPD-a。

图3 DPPH自由基清除能力比较

3 结论

通过初探重楼粗提物抑菌情况，结果表明，重楼粗提物对金黄色葡萄球菌有良好的抑菌效果，这为重楼在抑菌方面的应用提供了理论基础。通过对重楼粗提物进行进一步纯化，得到三组黄酮组分HPD-a、HPD-b、HPD-c，其中组分HPD-b提取率可达到2·13%。通过三种体外抗氧化实验比较粗提物和三种组分的抗氧化能力，结果表明重楼粗提物和重楼黄酮都具有良好的体外抗氧化能力。其中黄酮组分HPD-b比重楼粗提物的抗氧化能力更好，但均弱于Vc。