一株川金丝猴皮肤感染真菌的分离及鉴定

●李俊娴 邓长林 程家球 李梅荣

（南京市红山森林动物园 江苏 南京 210028）

红酵母（Rhodotorula）是担子菌亚门锈菌纲担孢目隐球菌科红酵母亚科红酵母属真菌，是一类产色素酵母菌[1]。研究认为，红酵母在空气、土壤和江河湖泊等水体中普遍存在，也可以存在于动物、植物以及人体上[2]。过去曾普遍认为红酵母属于无致病性的腐生菌和污染菌[3]，罕见导致人类感染。近年来，随着免疫低下人数逐渐增多，不断增加的侵袭性真菌感染案例引起研究人员的关注。继毛孢子菌属（Trichosporonspp·）、念珠菌属（Candidaspp·）、隐球菌属（Cryptococcusspp·）之后，红酵母菌属（Rhodotorulaspp·）成为引发侵袭性酵母菌感染的第四大类病原体，总体分离率4·2%（n=8821）[4]。经人医临床统计分析发现，血流感染、眼感染、心内膜炎、中枢神经系统感染、腹膜透析相关性腹膜炎、关节假体感染、皮肤感染等均为红酵母菌的感染类型，其中最常见的类型是导管相关性真菌血症[5-7]。红酵母属共包含8个种，胶红酵母是人医临床中最常见的致病种[1，7]。江苏某动物园一只川金丝猴皮肤见化脓性皮损。经分子生物学诊断为胶红酵母感染。此为国内首次发现川金丝猴皮肤感染胶红酵母。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要试剂 Taq Plus MasterMix、D2000 DNA Marker、GeneGreen核酸染料均购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.1.2 引物合成 真菌ITS扩增通用引物ITS1和ITS4由上海生工生物有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 病料采集和分离培养 用75%乙醇对患病川金丝猴皮损处消毒后，在相对无菌环境下采集皮损处样本，用无菌接种针蘸取皮损处病料，接种于沙堡液体培养基中，于30℃恒温摇床中连续培养48 h。取培养液于沙堡琼脂培养基上连续传代培养，获得纯化菌株。

1.2.2 总DNA提取 取经高压灭菌的0·2% SDS溶液400 μL于灭菌离心管中，取单菌落溶于溶液中，封闭离心管后涡旋振荡15 s，后沸水浴4 min，擦干离心管外壁后以12 000 r/min离心1 min，取上清液300 μL（病原菌总基因组DNA），冻存备用。

1.2.3 引物合成与PCR扩增 采用真菌rDNA内转录间隔区（ITS）序列通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）进行真菌ITS区扩增。

PCR反应体系：Taq Plus MasterMix 10 μL，引物各2 μL，病原菌总基因组DNA 2 μL，加ddH2O补足20 μL。PCR反应条件：98℃预变性3 min；98℃变 性10 s，59℃退火1·5 min，72℃延伸1·5 min，共30个循环；72℃延伸10 min，将PCR产物于4℃保存备用。取5 μL PCR产物于1%琼脂糖凝胶上电泳30 min后，通过凝胶成像仪进行检测。

1.2.4 PCR产物序列测定及系统发育树建立将PCR扩增产物寄送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序部进行克隆测序分析，获得片段序列后，在Gen Bank（http：//www·ncbi·nlm·nih·gov/blast）中进行分析BLAST比对，找出与其相似性最高的菌株。得到序列后用软件MEGA7·0进行分析，制作成系统发育树。

2 结果与分析

2.1 菌落形态与菌体形态

将分离株接种于沙堡琼脂培养基上，在30℃培养温度下生长速度一般，呈圆形酵母样菌落，菌落呈黏质状，菌落产生橘红色色素，光镜下见圆形或卵圆形酵母细胞，可见出芽生殖，未见假菌丝。

2.2 PCR扩增结果

取纯培养菌落提取总基因组DNA为PCR模板，并利用ITS1/ITS4引物对分离株的ITS区序列进行扩增。以1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，见一条长度介于500～750 bp之间的单一条带，与真菌ITS序列碱基大小范围相符，PCR对照组未见条带。电泳图如图1所示。

图1 分离株ITS序列扩增结果

2.3 分子生物学鉴定

将分离株的ITS1-ITS4 PCR扩增产物送交上海生工生物工程技术服务有限公司进行克隆测序，获得片段序列，如图2所示。检测结果显示，分离株ITS区片段碱基大小为616 bp。将测序结果在 GenBank 数据库中进行 BLAST 比对，发现与其他已报道的胶红酵母菌ITS序列相比，该分离株与MT465994·1同源性高达99%。根据同源性分析结果，选择同源性较高的34株不同参考菌株的序列为基础，建立进化树，结果见图3。根据BLAST比对结果和进化树中亲缘性分析得知，本研究中分离株为胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）。

图2 分离株ITS序列

图3 分离株 rDNA ITS 序列系统发育树

3 讨论

红酵母菌属是在自然界分布广泛的一类真菌，已在生物工程等领域有广泛的研究和应用，近些年被研究确认为条件致病菌，属罕见酵母菌[8]。胶红酵母感染在国内野生动物临床上尚未见报道。分离菌在本次川金丝猴感染上临床表现为感染处大面积脱毛，脱毛处皮肤覆盖有结痂，结痂较厚且呈微黄色，移除结痂后可见皮肤潮红，患处与正常皮肤有较为明显的分界线。未结痂患处可见大量点状脓疱颗粒，脓疱颗粒易受外力破坏破溃。感染导致患处附近淋巴结肿大。病猴表现明显抓挠患处的行为。临床兽医师选用宠物用氟康唑，按每0·1 mL/kg·bw皮下注射，每周注射1次，同时选用头孢曲松钠0· 5 g、阿米卡星1 mL肌肉注射，每日1次，连续治疗20日后，临床症状逐渐减退，患处皮肤痊愈，病猴抓挠患处行为逐渐消失。愈后3个月2次对患处皮肤进行复查，未见复发。红酵母菌细胞壁因缺乏1，3-β-D-葡聚糖合成酶，对棘白菌素类抗真菌药物有天然耐药作用[9]，故建议临床治疗中应注意甄别致病菌类型，根据致病菌种类选择合理药物治疗。人医临床上有研究表明，唑类药物特别是氟康唑对红酵母菌的最小抑菌浓度普遍≥64 mg/L[10]，棘白菌素类和/或氟康唑药物治疗下曾见红酵母暴发感染[11]。但在本例中使用宠物用氟康唑和其他抗生素及时治疗后能快速控制感染，可能与本次胶红酵母感染川金丝猴属皮肤感染型，危害性不大，相对深部感染更易治愈有关。朱敏等[12]曾报道1例女性患者因右乳房肿块穿刺活检术后致胶红酵母菌感染，出现真菌血症，未使用抗真菌药物也自行痊愈。在本次感染案例中，发现该川金丝猴患病后，饲养人员便快速将患病猴隔离，更换条件更好的笼舍进行饲养，加强护理，这些操作可能让动物自身抗病力有所提升而出现自愈。

经实地观察发现，患病川金丝猴被长期饲养在地势较低的笼舍中，存在通风不良的情况，室内笼舍相对阴暗潮湿。饲养员人员日常饲养管理内容局限于卫生清扫和饲喂，这些因素可能是形成此病的主要诱因。川金丝猴是典型性树栖动物，常年栖息在海拔1400～3300 m的常绿落叶阔叶林、针落叶混交林或针叶林中[13]。在我国南方地区圈养条件下虽不能完全复制野外环境条件，但应在笼舍设计时充分考虑笼舍朝向和结构等因素，设计建设通风和采光良好的笼舍，必要时需考虑利用仪器设备控制笼舍内湿度，以减少环境条件性致病菌。在饲养管理中注意环境卫生的清理和笼舍的消毒，可有效提升饲养环境质量。在日常操作中应注意运用综合性行为管理技术，加强动物与饲养员之间的信任关系，减少圈养条件下的应激反应，提高动物自身免疫力。这些措施都有助于减少动物被条件性致病菌感染的概率。

4 结论

胶红酵母虽属罕见酵母菌，但作为条件性致病菌的一种，可引起如川金丝猴这类野生动物皮肤感染，结合病原菌分离鉴定的实验室诊断手段可帮助确诊并合理选用治疗药物。在圈养环境中，野生动物可能因硬件或软件条件不足处于长期慢性应激压力下而出现条件性致病菌感染，故圈养野生动物应为动物提供通风、采光、温度、湿度均能良好控制的笼舍，与其自然栖息地条件相似，以科学尊重自然史的方式确定饲养管理程序，最大限度提高动物福利，减少条件性致病菌感染的发病率。