褪黑素缓解空肠黏膜上皮细胞氧化损伤的效果研究

2023-10-25康凌云韩露露韩德平陈建胜甘瀚凌邢凯马友记崔凯

生物技术通报 2023年9期

康凌云韩露露韩德平陈建胜甘瀚凌邢凯马友记崔凯

（1.甘肃农业大学动物科学技术学院，兰州 730070；2.中国农业科学院饲料研究所，农业农村部饲料生物技术重点实验室，北京 100081；3.中国农业大学动物医学院，北京 100193；4.北京农学院动物科学技术学院，北京 102206）

动物肠道是重要的营养物质吸收部位，与生长发育密切相关。同时肠道作为重要的先天黏膜免疫屏障器官，在防御病原感染和细菌毒素等方面发挥重要作用［1］。其中，黏膜上皮细胞是直接接触肠道内环境的细胞，包括柱状细胞、微皱褶细胞、杯状细胞、神经内分泌细胞等，它们的主要功能是吸收营养物质，同时也具有抗原递呈和分泌细胞因子的功能。另外，它们彼此间利用紧密连接蛋白相互嵌合形成一道物理性机械屏障［1-2］，减少肠道上皮的通透性，进而减少肠道内容物与黏膜固有层的接触。一旦上皮细胞发生病理性损伤，引起紧密连接蛋白减少，会增加肠道黏膜的通透性［3］。此外，肠道黏膜表面分泌有免疫球蛋白，上皮细胞间分布有大量先天淋巴细胞，固有层散在有各种免疫细胞，黏膜下层发育形成具有特定免疫细胞的弥散淋巴组织结构，它们构成了肠道黏膜重要的免疫屏障［4］。黏膜上皮细胞受到刺激后，会分泌一系列的调控介质，协调免疫细胞的应答反应，共同来维持肠道内环境的稳定［5］。

在饲养管理过程中，畜禽容易遭受各种应激源刺激，如夏季高温、长途运输、限制饲喂和早期断奶等［6-10］，它们均会引起肠黏膜屏障不同程度的损伤。这些应激因素会打破肠道内的微生态平衡，增加细菌粘附能力、黏膜上皮通透性和致病菌内毒素，进一步加重局部感染，诱导趋化大量炎性细胞迁移至感染部位，引起炎性损伤。严重时，黏膜上皮细胞死亡脱落，直接暴露黏膜固有层，增加肠腔内病原微生物的感染机会，诱发过激的炎症反应［11］。其中，多种应激因素的共同特点是引起局部自由基的蓄积，如超氧阴离子和羟自由基等，由此诱发氧化应激损伤［12］。所以，减少应激反应时自由基的产生和累积，可以保护黏膜上皮细胞损伤，有效地维护肠道黏膜屏障，减少饲养管理中的经济损失。

褪黑素具有提高机体免疫和抗氧化等多种生理功能，是目前众多内源性和合成的神经保护剂中关注和研究的热点［13-14］。研究发现，褪黑素（melatonin,MT）可以有效缓解氧化应激、增强固有免疫功能，而且这种缓解氧化损伤的能力在不同物种之间呈现出很强的保守性。褪黑素发挥免疫调节活性，主要是由免疫细胞上的褪黑素受体（MT1和MT2）介导，参与中性粒细胞、自然杀伤细胞、单核细胞和巨噬细胞等细胞的免疫调节作用［15-16］。在免疫抑制条件下，褪黑素通过结合T细胞表面MT受体促进效应T细胞的功能发挥，增加2型辅助性T细胞（T helper cell 2，Th2细胞）的免疫应答［17］。同时，褪黑素还可通过调控免疫调节因子和细胞因子的表达对免疫系统进行调节［18］。研究发现，采用褪黑素处理抗原致敏小鼠，可增加白介素-10（interleukin-10,IL-10）的表达，同时减少肿瘤坏死因子-α（tumour necrosis factor-α, TNF-α）的产生，进而诱导Th2细胞反应［19］。同时，褪黑素可增强小鼠巨噬细胞的抗原递呈能力，促进T细胞活化，增加主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC）分子和白介素-1（interleukin-1, IL-1）的表达［20］。当给予山羊褪黑素处理后，可以增加血清中炎症相关细胞因子的含量，增强机体免疫应答能力［21］。此外，肠道神经系统（enteric nervous system，ENS）遍布肠道组织，能够将收集到的信息迅速传递到自体的其它细胞［22］。最新研究报道发现，ENS可以作为免疫系统的感应平台作用于肠道上皮细胞，促进杯状细胞抗菌蛋白（antimicrobial protein，AMP）的表达，维持肠道稳态［23］。施用外源靶向神经递质受体的神经调节化合物对肠道上皮细胞黏液和抗菌蛋白（AMP）的分泌产生广泛影响［13］。研究发现，在人为模拟热应激条件下，通过添加褪黑素处理，可以有效缓解热应激造成的绵羊颗粒细胞的死亡，同时也可抑制绵羊成纤维细胞的凋亡［21,24］。而当给予小鼠和仔猪提前断奶处理，并同时饲喂外源性褪黑素，可以明显改善它们肠道黏膜屏障和免疫功能的受损情况，有效缓解提前断奶造成的应激反应［25-26］。综上，褪黑素可在抵抗畜禽肠道氧化应激损伤，维持黏膜屏障方面发挥重要作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞原代小鼠空肠黏膜上皮细胞，购自华普奥科生物科技（北京）有限公司。

1.1.2 试剂褪黑素（购买于Sigma，配制方法：将褪黑素用无水乙醇稀释至100 mmol/L，作为储液保存在-20℃冰箱中），上皮细胞完全培养基（赛百慷（上海）生物技术股份有限公司），Gibco胎牛血清、0.25%胰酶-EDTA、青链霉素和细胞培养用PBS（赛默飞世尔科技（中国）有限公司），硫酸亚铁和30%过氧化氢（国药集团化学试剂北京有限公司），丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、乳酸脱氢酶（LDH）、白细胞介素6（IL-6）、白细胞介素8（IL-8）ELISA检测试剂盒（上海酶联生物科技有限公司），4%多聚甲醛固定液（索莱宝科技有限公司），CK-18抗体（proteintech），Alexa Fluor 594 conjugated Goat Anti-Rabbit IgG（proteintech），MTT检测试剂盒（索莱宝科技有限公司），Trizol RNA提取试剂盒（Invitrogen公司），反转录试剂盒（天根生化科技有限公司），实时荧光定量PCR试剂盒（天根生化科技有限公司）。

1.1.3 仪器和工具 CO2细胞培养箱（上海博迅实业有限公司），酶标仪（美国BioRad iMark），倒置荧光显微镜（Leica），超微量分光光度计（Thermo Scientific，德国），苏州净化双人超净工作台（LR-1500CP），恒温水浴锅，细胞培养板（美国康宁）。

1.2 方法

1.2.1 原代空肠黏膜上皮细胞培养及免疫荧光鉴定原代小鼠空肠黏膜上皮细胞，用含100 mL/L的胎牛血清和10 g/L青链霉素的DMEM培养基培养，置37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。当细胞长满至80%-90%左右时，用0.25%胰酶-EDTA消化细胞，按照1∶2的比例进行传代培养。后续试验过程中所用细胞均在F6代内。

将细胞按2×104个/孔接种于96孔板，待细胞贴壁后，吸弃培养基，用PBS清洗两次。加入800 μL 4%多聚甲醛溶液，室温固定20 min。PBS清洗2次，加入800 μL 0.1% triton X-100室温孵育10 min。PBS清洗2次，3%过氧化氢室温处理15 min。PBS清洗2次，加入，4℃孵育过夜。PBS清洗3次，加入二抗37℃孵育1 h。PBS清洗3次，加入500 μL即用型DAPI溶液，室温处理5 min。PBS清洗3次，于倒置荧光显微镜下观察。

1.2.2 细胞氧化损伤模型将F3代空肠黏膜上皮细胞按2×104个/孔接种于96 孔板，置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养。待细胞长满至80%左右，加入200 μL含不同浓度FeSO4和H2O2（0、2.5、5、10、20、40、80 mmol/L）的DMEM培养基继续培养3 h。小心吸去上清，加入90 μL新鲜培养液，再加入10 μL 5 mg/mL MTT溶液，继续培养4 h。然后吸掉上清，每孔加入110 μL Formazan溶解液，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值。同时设置调零孔（培养基、MTT、Formazan溶解液），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、Formazan溶解液），每组设定5个重复孔。

1.2.3 褪黑素缓解氧化损伤分析将F5代空肠黏膜上皮细胞按2×104个/mL接种于6孔细胞培养板,待细胞完全贴壁后，吸弃上清，每孔加入800 μL不同浓度的褪黑素（MT）溶液（终浓度分别为5、10、15、30、50、100、150、250、500 μmol/L），置37℃、5% CO2培养箱中继续培养2 h。同时设置空白组（CON）和氧化损伤模型组（FeSO4/H2O2），空白组不做任何处理。褪黑素处理2 h后，吸弃对照组和褪黑素处理组的细胞上清，分别加入2 mL含10 mmol/L FeSO4和H2O2的DMEM培养基，继续培养3 h。然后，吸取细胞上清，6 000 r/min离心10 min，弃沉淀，留取上清液进行相关指标的ELISA检测。

1.2.4 ELISA检测设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL，待测样品孔中先加样品稀释液40 μL，然后加待测细胞上清10 μL。每孔加入酶标试剂100 μL，用封板摸封板后37℃温育60 min。洗涤液重复洗涤5次，尽量拍干。每孔分别加入显色剂A和B各50 μL，37℃避光显色15 min。每孔加终止液50 μL终止反应，于450 nm波长测定各孔的吸光度。其中，检测指标包括MDA、SOD、CAT、GSH-Px、LDH、IL-6和IL-8。

1.2.5 核酸提取和RT-qPCR反应使用Trizol RNA试剂盒提取细胞总RNA；使用NanoDrop ND-2000分光光度计对提取的 RNA 浓度和纯度进行检测，选取OD260/ OD280介于 1.8-2.1，OD260/ OD230大于2.0的RNA 样品，并经1%的琼脂糖凝胶电泳对其完整性进行检测。选择质量合格的RNA样品，按反转录试剂盒操作说明中的两步法完成cDNA第一链的合成。从NCBI数据库中检索羊TNF-α（NM_001024860.1）、IL-1β（NM_001009465.2）、IL-6（NM_001009392.1）的mRNA序列，并利用Pick Primers进行引物设计，之后通过NCBI上的Blast检测引物特异性，最后由上海生工生物公司合成，引物序列见表1。以反转录得到的cDNA为模板，按照实时荧光定量PCR试剂盒建议的体系进行RT-qPCR扩增。RT-qPCR扩增体系：2×SR PreMix Plus 10 μL，上、下游引物各 0.5 μL，cDNA模板 1 μL，RNase-Free ddH2O 8 μL，每个独立的试验至少重复 3 次。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

1.2.6 数据分析所有数据经过Excel初步整理后，采用SAS 9.2软件（SAS Inst.Inc., Cary, NC）进行分析。使用one-way ANOVA模型分析，单因素为不同的处理方式，P ＜ 0.05和P ＜ 0.01为差异显著，具有生物统计学意义。

2 结果

2.1 空肠黏膜上皮细胞可进行分离培养

对原代分离培养的空肠黏膜上皮细胞进行形态学观察，发现该细胞呈现铺路石样生长（图1-A，1-B）。经传代培养后，发现该细胞可稳定传代10代以上。经CK-18免疫荧光染色后发现，该细胞呈明显强阳性表达（图1-C，1-D），纯度达到90%以上。说明分离的细胞是空肠黏膜上皮细胞，纯度较高，可用于后续实验。

图1 空肠黏膜上皮细胞形态及CK-18免疫荧光染色Fig.1 Jejunum epithelial cell morphology and CK-18 immunofluorescence staining

2.2 FeSO4 /H2O2处理可引起黏膜上皮细胞明显氧化损伤

为了探索FeSO4/H2O2处理粘膜上皮细胞一定时间后造成的损伤情况，以不同浓度（0、2.5、5、10、20、40、80 mmol/L）的FeSO4/H2O2处理接种细胞的96孔板，利用MTT法检测其在相同作用时间下对黏膜上皮细胞的影响。结果如图2所示，利用FeSO4/ H2O2处理黏膜上皮细胞，可明显引起细胞氧化损伤，与空白组细胞相比（图2-A），FeSO4/ H2O2处理后，黏膜上皮细胞皱缩变圆，大量细胞脱落（图2-B）。

图2 FeSO4/H2O2处理可明显引起黏膜上皮细胞氧化损伤Fig.2 FeSO4/H2O2 treatment significantly causing the oxidative damage to mucosal epithelial cells

MTT结果表明，FeSO4/ H2O2处理后，细胞存活率明显下降（图2-C，P ＜ 0.05），且MDA的含量在FeSO4/ H2O2处理后显著增加（图2-D，P ＜0.05）；图2-E的结果表明，细胞的致死率随FeSO4/H2O处理浓度的增大而增大，且呈现出明显的依赖性，不同处理组的细胞致死率与正常对照组差异显著（P＜0.05）。2.5、5、10、20、40、80 mmol/L FeSO4/H2O2处理后，细胞的存活率分别为80.1%、70.5%、65.8%、58.9%、38.1%、21.6%（图2-E），其中40、80 mmol/L FeSO4/ H2O2作用黏膜上皮细胞后，细胞成片脱落，大量死亡，造成不可逆损伤，无法利用药物进行修复。

综合分析MTT和MDA结果，决定使用10 mmol/L 的FeSO4/H2O2处理空肠黏膜上皮细胞，建立氧化损伤模型用于后续实验分析。

2.3 褪黑素对黏膜上皮细胞具有明显的抗氧化保护作用

为了探索不同浓度外源添加褪黑素对空肠黏膜上皮细胞具有明显的抗氧化保护作用，我们分别以不同的浓度（5、10、15、30、50、100、150、250、500 μmol/L）的褪黑素处理接种细胞的96孔板，利用MTT法检测不同浓度褪黑素在不同作用时间下对黏膜上皮细胞的影响。如图3-A所示，褪黑素浓度为5-15 μmol/L时，细胞存活率＞90%，而当其浓度超过100 μmol/L时，会对空肠黏膜上皮细胞产生伤害；因此我们选择10 mmol/L褪黑素作为后续的安全浓度。Calcein-AM/PI双染结果显示，褪黑素的添加明显缓解了FeSO4/H2O2引起的氧化损伤，死细胞数量大幅度下降（图3-B，3-C），这表明褪黑素对空肠黏膜上皮细胞具有明显的抗氧化保护作用。

图3 褪黑素处理可明显缓解黏膜上皮细胞的氧化损伤Fig.3 Melatonin treatment significantly ameliorating the oxidative damage to mucosal epithelial cells

同时，与对照组相比，FeSO4/H2O2处理明显引起细胞氧化应激，MDA的表达显著增加（表2）；而添加不同浓度的褪黑素预处理后，MDA的表达明显减少（P＜0.05）。此外，FeSO4/H2O2的处理可引起黏膜上皮细胞中LDH的显著提高，而预先加入0.01 mmol/L和1 mmol/L的褪黑素，可明显减少LDH的释放。FeSO4/H2O2处理能够降低黏膜上皮细胞表达SOD、GSH-Px和CAT的表达，而通过外源添加不同浓度的褪黑素后，可显著提高GSH-Px在黏膜上皮细胞内的表达（P＜0.05）。

表2 不同浓度褪黑素预处理对黏膜上皮细胞抗氧化因子的表达影响Table 2 Effects of pretreatment with different concentrations of melatonin on the expressions of antioxidant factors in mucosal epithelial cells

2.4 褪黑素可调节黏膜上皮细胞炎性因子表达

外源添加褪黑素可影响黏膜上皮细胞炎症反应相关因子的表达（图4）。检测发现，10 mmol/L 的FeSO4和H2O2氧化损伤模型并没有明显影响黏膜上皮细胞IL6和IL8的含量变化。但是，与对照组和氧化损伤模型组相比，1 mmol/L的褪黑素处理后，黏膜上皮细胞显著降低了IL-6的表达（P＜0.05）。而10 mmol/L褪黑素添加可显著增加黏膜上皮细胞内IL-8的含量（P＜0.05）。应用 RT-qPCR，以内参基因β-actin对各组TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表达量进行校正；结果如图5所示，TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA 表达水平与ELISA检测结果基本一致，说明外源添加褪黑素可影响黏膜上皮细胞炎症反应相关因子的表达。

图4 褪黑素调节黏膜上皮细胞氧化损伤时IL-6和IL-8的表达Fig.4 Melatonin regulating the expressions of IL-6 and IL-8 during oxidative injury of mucosal epithelial cells

图5 褪黑素调节粘膜上皮细胞氧化损伤时TNF-α、IL-1β及IL-6的mRNA表达水平Fig.5 Melatonin regulateing the mRNA expression of TNF-α, IL-1β and IL-6 during oxidative injury of mucosal epithelial cells

3 讨论

氧化应激主要与活性氧的大量累积有关。活性氧（reactive oxygen species, ROS）主要包括超氧阴离子、过氧化氢和羟自由基，其作为重要的第二信使可启动细胞内特定信号通路，通过调控相关基因的表达而维持细胞的特定生理功能［27］。而当ROS产生过多时，超过了机体的抗氧化能力，会引起ROS在体内的异常蓄积。此时，ROS失去了正常的生理调节功能，反而会导致细胞核DNA和线粒体DNA突变或缺失，细胞膜脂质过氧化和蛋白氧化损伤，进而造成细胞内膜流动性改变、重要酶失活，最终导致细胞凋亡和组织结构损伤［28］。已经有研究发现，氧化应激可引起机体氧化损伤，与多种病理过程密切相关。如心肌缺血再灌注损伤时心肌细胞的凋亡、睾丸支持细胞和精子细胞的损伤、神经元氧化应激损伤、卵巢衰老及储备功能下降等［29-33］。我们发现，FeSO4和H2O2反应产生的氧自由基和羟自由基，可引起肠黏膜上皮细胞的明显损伤，导致细胞皱缩变圆，并形成凋亡小体，说明自由基确实可引起肠黏膜上皮细胞的明显凋亡和坏死。

机体内存在重要的抗氧化防御机制，主要包括抗氧化酶和各种抗氧化活性物质［34-35］。其中，抗氧化酶包括SOD、CAT、还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、GSH-Px等。抗氧化活性物质包括褪黑素、α硫辛酸、谷胱甘肽、类胡萝卜素、维生素C和E、微量元素铜锌硒锰等。我们发现FeSO4和H2O2引发的氧化损伤，可引起肠黏膜上皮细胞抗氧化酶的表达下降，而通过添加褪黑素后，细胞内抗氧化酶的表达明显增加，抗氧化能力明显增强。

此外，炎症反应伴有大量炎性细胞的浸润和免疫应答，它们在发挥免疫效应的同时，细胞也会产生大量自由基［36］。如果机体此时抗氧化能力下降或由于组织损伤缺失抗氧化能力，便会进一步加剧炎性损伤。伴随着活性氧自由基的积累，动物血液中IL-1β、IL-6、TNF-α及IFN-γ等促炎性细胞因子表达水平升高，进而诱发剧烈的炎症反应［37-38］；而IL-8则被认为是非常重要的中性粒细胞分化诱导物，具有抗炎作用［39］。我们的研究结果表明，褪黑素可以引起肠黏膜上皮细胞炎性细胞因子IL-6的表达下降，而趋化因子IL-8的表达上升，说明褪黑素可以减少炎性因子对上皮细胞的损害，还可通过趋化诱导其它免疫细胞的迁移来修复局部黏膜上皮的损伤。RT-qPCR结果进一步证实了这一结论，添加褪黑素后，细胞内IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平均较之氧化应激组有所下调，说明褪黑素可以减缓氧化应激诱导的肠道免疫损伤。