NH3和H2S降解功能菌的分离鉴定及降解特性研究

江海溶 崔若琪 王玥 白淼 张明露 任连海

（北京工商大学生态环境学院国家环境保护食品链污染防治重点实验室，北京 100048）

2019年起，我国地级及以上城市全面开展垃圾分类工作，其中将厨余垃圾单独收集成为生活垃圾分类收集的重点工作［1］。厨余垃圾具有含水率高、有机质高、含盐量高、含油量高和易腐烂等特点，若处理不及时易产生恶臭，并会滋生病原微生物，引发环境污染问题［2-3］。厨余垃圾所产生的恶臭不仅刺激人的嗅觉器官，而且很多组分是有毒有害气体，对人体及动植物造成危害［4］。恶臭气体种类有很多，包括：H2S、SO2、NH3、CH4和二恶英等，虽然不同地区产生的厨余垃圾主要成分有所区别，但其中NH3和H2S是较为典型的恶臭气体［5-6］。

目前对控制恶臭气体的研究工作主要集中在化学除臭、物理除臭和生物除臭三方面。生物除臭以除臭效率高、无二次污染、操作简单、成本低廉，成为治理恶臭环境的一个重要研究方向［7］。近年来，研究工作多集中在高效除臭优势菌株的选育，推广应用的研究多采用外国进口的微生物制剂，以韩国的钮咳厉恶、德国的洁博士、日本的EM菌剂为主［8-10］。目前国内选育和复配的微生物除臭剂研究起步较晚，菌株除臭效果相对国外进口的微生物菌剂存在一定的差距［11-12］。

本研究通过多种除臭微生物菌种的筛选，以NH3和H2S的降解率为除臭筛选指标，优选降解效率最高的菌株，确定其最佳培养条件和混合比例，最终混合成微生物除臭剂，应用于厨余垃圾臭气的降解。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 用无菌桶从北京工商大学东区学校食堂收集约1 kg厨余垃圾至化工楼实验室，用小型破碎机破碎后备用。取10 g厨余垃圾进行实验使用，剩余样品在4℃冰箱保存。

1.1.2 培养基 实验培养基配方如下：

NH3降解菌筛选培养基［13］：蔗糖50.0 g，KH2PO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.1 g，1% ZnSO45 mL，NaCl 2.0 g，氨水10.0 mL，加蒸馏水至1 000 mL，121℃灭菌20 min，氨水过滤除菌后加入；

H2S降解菌筛选培养基［14］：蛋白胨10.0 g，牛肉膏2.0 g，NaCl 5.0 g，Na2S 2.0 g，加蒸馏水至1 000 mL，121℃灭菌20 min；

异养硝化培养基［15］：C6H5Na3O75.0 g，（NH4）2SO40.45 g，K2HPO40.25 g，FeSO40.0025 g，NaCl 0.125 g，MgSO40.06 g，MnSO40.001 g，琼脂粉15.0 g，加蒸馏水至1 000 mL，pH=7.0，121℃灭菌20 min；牛肉膏蛋白胨培养基：称取牛肉膏蛋白胨培养基33 g，加蒸馏水至1 000 mL，121℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 NH3和H2S降解菌的富集与纯化 经20 000 r/min离心处理后的厨余垃圾，取100 μL上清液分别接入NH3和H2S选择性培养基，进行富集驯化［16］。将特征不同的菌落划线纯化至单菌后，分别吸取200 μL菌液于相应的斜面培养基上培养后，保存备用，挑取分离后的菌株接种于相应的液体培养基上，30℃、130 r/min，摇床扩大培养72 h。

1.2.2 NH3和H2S降解菌的初筛 将分离纯化获得的菌株制作成5 mL菌液，接入装有50 g新鲜厨余垃圾的1 000 mL广口瓶中，混匀，同时以接种5 mL无菌水的厨余垃圾样品作为对照，双层塑料膜密封，置于30℃，130 r/min恒温摇床中发酵。发酵24 h后采用感官法对恶臭气体强度进行评定，实验重复3次，将除臭能力明显的菌株进行复筛试验［17］。

1.2.3 NH3和H2S降解菌的复筛 选择初筛中具有较好除臭效果的菌株进行复筛试验，以10% 接种量将菌株接种至相应的NH3和H2S降解菌培养基，培养成菌液，置于30℃，130 r/min恒温摇床中培养48 h。每个菌株做3组平行，同时设置空白对照组。实验组与空白组进行差异显著性分析，计算NH3与H2S的降解率，确定NH3与H2S降解率较高的菌株。

1.2.4 最佳NH3和H2S降解菌的筛选 将复筛菌株的菌液接种于对应的培养基中，置于30℃，130 r/min恒温摇床中培养，设置空白对照组，每个菌株做3组平行。培养24 h后取出菌液，计算出氨氮浓度和硫酸盐浓度［18-19］，最终得出最佳NH3降解菌株和H2S降解菌株。

1.2.5 菌株的鉴定 采用革兰氏染色法对分离得到的菌株进行形态学观察，分子生物学鉴定由北京开泰明镜基因科技有限公司进行16S rDNA测序鉴定。16S rDNA基因扩增的PCR引物为细菌通用引物，上游引物（341F）5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′，下游引物（785R）5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′。扩增反应体系为25 μL，其中，上、下游引物各0.25 μL、模板DNA 2 μL，2×Mastermix 12.5 μL，ddH2O 10 μL。扩增反应条件为95℃使DNA预变性3 min；95℃使DNA变性30 s，55℃引物退火30 s，72℃延伸30 s，25个循环；最后72℃延伸5 min将PCR产物纯化后加入到 Illumina Novaseq 6000 测序平台进行高通量测序，得到测序结果后通过BLAST程序与NCBI GenBank中核酸数据进行比对分析，查找与各菌株相似性最高的菌株序列［20］。

1.2.6 菌株培养条件优化 将分离得到的两株细菌分别制作液体培养物，温度梯度设置为25℃、30℃、35℃、40℃，培养48 h，每隔4 h取样测量OD600值，根据生长曲线变化情况，选择最佳培养温度。在最佳培养温度下依次设置不同梯度的接种量、pH、C/N、碳源、氮源，130 r/min条件下摇床振荡培养48 h后测定菌株的降解率，每组试验做3组平行，最终取平均值（表1）。

表1 除臭条件优化实验设计Table 1 Experiment design of optimal deodorizing conditions

1.2.7 混合培养对臭气的降解效果 将获得的两株菌株在牛肉膏平板培养基上进行交叉划线，观察交叉点是否有菌株生长情况，两者能生长为不拮抗，一株或两株都不能生长为拮抗。若两株菌株不产生拮抗，将其分别制作液体培养物，在最佳培养条件下，混合比例依次设置为1∶1、1∶2、2∶3、3∶2、2∶1，130 r/min的摇床震荡培养48 h，每隔4 h取出菌液，测量pH变化情况和吸光度，绘制浓度曲线，选择最佳混合比例。在最佳混合比例下，培养72 h，每隔4 h取样，检测氨氮和硫酸盐离子浓度变化情况，计算氨氮降解率和硫酸盐生成率。每组试验做3组平行，最终取平均值。

1.2.8 分析方法 复筛降NH3试验：硼酸吸收凯氏定氮法［21］；复筛降H2S试验：锌铵络盐比色法［22］；NH3降解效率的测定：纳氏试剂分光光度法［23］；H2S降解效率的测定：采用铬酸钡分光光度法［24］。

1.2.9 数据处理 采用 Microsoft Office Excel 2022进行数据处理，Origin Pro 2021bS R2进行作图。

2 结果

2.1 降解菌株的筛选

利用选择性培养基共筛选到菌株40株，其中NH3降解菌株中细菌（CN）10株、真菌（PN）5株、乳酸菌（MN）5株，H2S降解菌株中细菌（CS）10株、真菌（PS）5株、乳酸菌（MS）5株。将气味评判等级4、5的16株菌株去除，剩余24株菌株进入复筛阶段。

复筛采用降NH3和降H2S实验，计算培养液中NH3和H2S含量，与空白中的含量进行对比，最终得出菌种所对应的NH3或H2S的去除效率，选取去除率达到60%以上的菌株进行NH3和H2S的高效降解菌的筛选。根据表2可知，共有8株菌株可进入复筛，其中可降解NH3的编号为：CN5、CN10、PN1、PN3，可降解H2S的编号为：CS2、CS4、CS6、CS7。

表2 筛选结果及其降解率Table 2 Screening results and degradation rates

2.2 最佳NH3和H2S降解菌的筛选及鉴定

由图1-A可知，最佳NH3降解菌株编号为CN5，24 h后CN5菌液中氨氮含量最低为103.5 mg/L，NH3去除率为83.1%。由图1-B可知，最佳H2S降解菌株编号为CS2，24 h后CS2菌液中硫酸盐生成含量最多为304.2 mg/L，H2S去除率为87.2%。如图2-A所示CN5菌为革兰氏阳性菌，显微镜下呈现琏球状，菌落大，黄色不透明，边缘清晰，较湿润容易挑取，单菌培养时生长速度较慢。如图2-B所示CS2菌为革兰氏阴性菌，显微镜下呈现长卵状，菌落细小，白色通透，边缘清晰，湿润容易挑取，单菌培养时生长速度快。对菌株的DNA进行PCR扩增及16S rDNA基因鉴定后，系统发育树如图3所示，根据BLAST结果，菌株CN5与Enterococcuss casseliflavus NCIMB 11449的相似性为99%，菌株CS2和Pseudomonas geniculata ATCC 19374的相似性为99.78%，说明分离菌株CN5属于肠球菌属（Enterococcus sp.），菌株CS2属于假单胞菌属（Pseudomonas sp.）。

图1 菌株对氨氮（A）和硫酸盐（B）的转化情况Fig.1 Transformation of ammonia nitrogen（A）and sulfate（B）by strains

图3 菌株CN5和CS2的系统发育进化树Fig.3 Phylogenetic tree derived from 16S rDNA sequences of the CN5 and CS2 strains

2.3 NH3和H2S降解菌培养条件优化

由图4可知，菌株CN5和CS2的OD600均在35℃温度下达到最大值，说明35℃条件下菌株生长最旺盛。如图5-A所示，接种量为10%时菌株对NH3和H2S的降解率最高，分别为83%和86.3%。菌株CN5更适合在碱性条件下生长，在初始pH为7-8.5时，降解效果较好，降解率接近85%；菌株CS2更适合在酸性条件下生长，在初始pH为6-7.5时，降解效果较好，降解率均在85%以上（图5-B）。以原始培养基中碳源氮源为基底，初始碳氮比为25∶1时，两株菌株对两种气体的降解效果均最佳，降解率可达84.7%和88.9%（图5-C）。当以蔗糖和氯化铵作为唯一碳源和氮源时，两菌株均能达到最佳降解效果，NH3降解率均接近85%，H2S降解率均在85%以上（图5-D，5-E）。综上两菌株培养的最优条件：接种量为10%，培养温度为35℃，初始pH为7，碳氮比25∶1，碳源为蔗糖，氮源为氯化铵。

图4 菌株在不同温度培养时的OD600值Fig.4 OD600 value of strains cultured at different temperatures

图5 菌株CN5和菌株CS2在不同培养条件下降解率的变化Fig.5 Changes in degradation rates of strain CN5 and strain CS2 under different culture conditions

2.4 最佳混合比例的确定

在平板上将菌株交叉十字划线，两菌株交叉点生长良好，说明菌株彼此之间没有拮抗作用，可以进一步进行最佳除臭组合的筛选。由图6可知，菌株CN5和CS2以2∶3的比例接入时，OD600值最大，菌株生长最旺盛。由图7可知，菌株CN5和CS2以2:3的比例接入时，pH值在7左右保持稳定。在上述单因素优化条件得出的最佳培养条件下，混合菌剂对NH3的降解率达到86.3%，对H2S的降解率达到91.2%。相较于图5中单个菌株对NH3和H2S的降解率分别为84.7%和88.9%，两菌在混合状态下产生的协同作用，能进一步提高NH3和H2S的降解率。

图6 两菌株不同混合比例下OD600的变化Fig.6 Changes of OD600 under different mixing ratios of two strains

图7 两菌株不同混合比例下pH的变化Fig.7 Changes of pH under different mixing ratios of two strains

2.5 氨氮含量和硫酸盐含量测定

通过氨氮含量和硫酸盐含量测定实验，进一步确认两株菌的降解能力，由图8可知，在0-24 h内，氨氮浓度呈现指数下降趋势，硫酸盐浓度呈现指数上升趋势，两者变化幅度均较大。在24-72 h，氨氮和硫酸盐离子浓达到饱和后基本保持不变。最终氨氮浓度稳定在50.5 mg/L，氨氮降解率为85.3%，相较于图1-A中未优化条件下氨氮降解率83.1%，优化条件下氨氮降解率提高了2.2%。硫酸盐浓度稳定在302.7 mg/L，硫酸盐生成率为89.2%，相较于图1-B中未优化条件下硫酸盐生成率87.2%，优化条件下硫酸盐生成率提高了2.0%。

图8 两株菌混合条件下氨氮和硫酸盐离子浓度变化曲线Fig.8 Variation curve of ammonium nitrogen and sulfate ion concentration under mixed conditions of two strains

3 讨论

微生物对臭气的降解率与接种量、pH有密切关系，接种量过低降解效果不明显，接种量过高导致菌种繁殖过于旺盛产生多余的代谢物质，影响降解效率。本研究中接种量为10%时菌株生长最旺盛，对NH3和H2S的降解率最高。pH值是影响微生物活性的重要因子之一，其值太小或太大都会影响菌剂除臭效果，一般适宜微生物生长的pH值环境是中性左右，本研究中最适宜两株菌生长的pH为7，与现有研究一致。张红玉等［25］研究表明碳氮比为25∶1时，是微生物生长繁殖以及分解有机物的最佳条件，能够保证能量和氮素来源都不会受到限制。本研究中最佳碳氮比为25∶1与现有参考文献一致，碳氮比过高和过低都不利于细胞生长和外源蛋白表达和积累，过低导致菌体提早自溶；过高导致细菌代谢不平衡，最终不利于产物的积累［26］。蒋敏［27］在对厨余垃圾好氧堆肥高效菌剂的研发中发现葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖和淀粉均是容易被微生物利用的碳源，其中添加蔗糖作为碳源可在实验前期加快细胞增殖。本研究中蔗糖为提高NH3和H2S降解率的最佳碳源。同时，氮源也是影响菌剂除臭效果的重要因素，一定的氮源能够促进微生物菌剂对恶臭气体的分解，加快反应时间和效率。夏远舰等［28］对异养硝化-好氧反硝化菌最佳氮源的研究中发现，由于氯化铵中含有可促进菌剂代谢的氨氮离子，因此添加氯化铵作为唯一氮源时菌株作用效果最佳，本研究中最佳氮源也为氯化铵，对NH3和H2S降解率均可达到85%。

在菌株混合培养方面，Van Ransbeeck等［29］研究表明，臭气成分复杂，每一种臭气都需要特定的微生物来降解，单一菌株除臭效果低于多种微生物共同作用的效果，两株菌接种于同一体系中互利共生，联合作用，可在一定程度上提高生长繁殖能力。史钻红等［30］研究表明厨余垃圾的pH一般为中性偏酸性，因此两株菌混合，偏向于酸性条件的菌株CS2添加相对比例高时，除臭效果更明显。肠球菌已有多个研究表明具有除臭作用［31-33］，对NH3降解效果可达70%以上，同时对CH4、甲醛、二恶英等恶臭气体也有一定的降解作用。假单胞菌也有研究表明具有较好的除臭效果［34-36］，常常应用于污水处理厂污泥臭气降解，对H2S降解效果最佳，最高达到95.1%，同时对甲硫醇、甲硫醚、NH3等恶臭气体也有一定的降解效果。本研究中两菌混合对NH3和H2S的降解效果明显优于单菌的降解效果，产生协同作用促进NH3和H2S的降解，最终对NH3的降解率达到86.3%，对H2S的降解率达到91.2%，明显高于单个菌株对NH3和H2S的降解率。

有研究表明［37-38］，垃圾中含有大量的NH4+和S2-，是NH3和H2S的主要产生来源。处于旺盛生长的对数生长期的菌种活性高，因此会大量消耗NH4+，生成硝酸盐和亚硝酸盐，同时大量分解S2-，产生硫酸盐，SO42-离子浓度增加。待细菌逐渐达到衰亡期后，各离子浓度平稳。目前筛选除臭菌株一般都是在48 h之后才能获得最佳除臭效果，曾苏等［39］研究的菌株生长的变化在60 h后才趋于稳定，最大值氨氮和硫酸盐的离子浓度变化为80.05%和65.03%，在72 h后降解效果下降。张鉥孟等［40］研究的一株脱氮硫杆菌中，菌株在48 h后趋于稳定，最大值氨氮和硫酸盐的离子浓度变化为67.18%和63.85%，低于本研究中两株菌株的混合效果。本研究筛选的两株菌在40 h左右趋于稳定，在72 h仍有明显降解效果。相对其他研究，该混合菌株氨氮降解率和硫酸盐离子转化率更高，持续时间更长，因此具有更佳除臭效果。

4 结论

从厨余垃圾中分离出能够高效降解NH3和H2S的菌株各1株，鉴定菌株CN5属于肠球菌属（Enterococcuss sp.），为革兰氏阳性菌；CS2属于假单胞菌属（Pseudomonas sp.），为革兰氏阴性菌。菌株最佳除臭条件为：接种量为10%，培养温度为35℃，初始pH为7，碳氮比25∶1，碳源为蔗糖，氮源为氯化铵。在混合比例为2∶3时，对NH3和H2S的去除效果最佳，且pH值稳定在中性偏酸性，NH3降解率为86.3%，H2S降解率为91.2%。在72 h内，最终氨氮浓度稳定在50.5 mg/L，氨氮降解率为85.3%；硫酸盐浓度稳定在302.7 mg/L，硫酸盐生成率为89.2%。