枯草芽孢杆菌Ya-1对辣椒枯萎病的防治及其对根际真菌群落的影响

2023-10-25赵志祥王殿东周亚林王培严婉荣严蓓罗路云张卓

生物技术通报 2023年9期

赵志祥王殿东周亚林王培严婉荣严蓓罗路云张卓

（1.海南省农业科学院植物保护研究所，海南省农业科学院农产品质量安全与标准研究中心，海南省植物病虫害防控重点实验室，海口 571100；2.长江师范学院现代农业与生物工程学院，重庆 408100；3.麻阳县农业农村局植保植检站，怀化 419400；4.湖南省农业科学院植物保护研究所，园艺作物病虫害治理湖南省重点实验室，长沙 410125；5.湖南农业大学植物保护学院，长沙 410128）

辣椒（Capsicum annuum L.）是一种重要的蔬菜，在中国种植面积超过130万hm2。辣椒枯萎病是由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）侵染引起，在许多国家均有发生［1-3］，在我国陕西、甘肃、湖南等地相继发生，发病率一般为15%-30%，严重时50%以上，甚至绝产［4］。化学防治是目前使用最多、最有效、最易让人接受的防治方法。但是长期大量使用单一化学药剂，易诱导病菌产生抗药性，并且对土壤生物群落造成较大的影响，导致土壤肥力下降［5-6］。因此减少或取代化学药剂在防治辣椒枯萎病中的应用，在降低健康危害、环境破坏和污染等方面显得尤为迫切。根际是土壤、植物和微生物三者相互作用的生态环境［7］，而根际微生物是土壤生态系统中最为活跃的组成部分，在植物生长过程中起着重要作用，能把土壤中的有机物和一些难分解的物质分解转化，为植物生长提供肥沃的土壤［8］。通过调控根际土壤微生物群落结构抑制土壤病原菌，将逐步取代传统的化学防治手段，具有较为广阔的应用前景。

利用生防细菌、真菌及放线菌等拮抗微生物的寄生、抗生作用，及其与病原菌的营养物质、生态位的竞争效应，抑制和消灭病原菌是防治辣椒枯萎病的有效措施之一。芽孢杆菌已被证明对尖孢镰刀菌具有较强的拮抗作用，是重要的辣椒枯萎病生防细菌。本研究中拮抗细菌Ya-1，经鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），来源于海南五指山热带雨林土壤，对辣椒枯萎病菌具有较好的抑制效果。Xu等［9］发现解淀粉芽孢杆菌SQR9分泌的脂肽类化合物芽孢菌霉素D对尖孢镰刀菌等土传病原生物具有较强的抑制活性。吴月等［10］报道芽孢杆菌或假单胞杆菌等对辣椒枯萎病菌有较好的抑制作用。郭珺等［11］报道芽孢杆菌pb-4能明显抑制辣椒枯萎病菌孢子的萌发。Jamal等［12］研究发现施用B.amylliquefaciens Y1可以提高辣椒叶片的叶绿素含量，同时显著提高土壤全氮、可培养细菌和产几丁质酶细菌的数量以及几丁质酶和脱氢酶的活性。Cao等［13］分离出高拮抗活性的芽孢杆菌菌株2株，B.velezensis Y6和F7，其对辣椒枯萎病菌和茄科青枯病菌在室内和盆栽条件下均有较好的抑菌活性，其活性物质Iturin对辣椒枯萎病菌具有持续的抑菌效果。Chowdhury等［14］发现芽孢杆菌LBF-01对辣椒尖孢镰刀枯萎病菌有较好地抑菌活性，同时促进辣椒生长，田间实验能降低9.04倍的枯萎病发生率，减少50%的多菌灵使用，并能增加种子的萌发率。Ben等［15］研究发现枯草芽孢杆菌V26能溶解无机磷酸盐、固氮，产生吲哚乙酸、铁载体和水解酶，并对尖孢镰刀菌具有较好的抑菌活性。

根据生态学原理，通过对辣椒根区土壤接种外来菌，调节植株根区的微生物群落结构，有可能从根本上控制辣椒枯萎病。枯草芽孢杆菌Ya-1作为辣椒枯萎病的生防微生物，其对罹病枯萎病辣椒根际土壤真菌群落的影响仍然未知。本研究以枯草芽孢杆菌Ya-1为材料，采用高通量测序技术重点研究接种生防菌对罹病辣椒根际土壤真菌群落结构、关键种群的影响及动态变化，从微生物角度为芽孢杆菌调控微生态环境来抑制辣椒枯萎病的新途径提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验地点位于海南省农科院植物保护研究所，试验辣椒品种为‘乾隆一号’。供试病原菌为辣椒枯萎病菌镰刀尖孢菌（Fusarium oxysporum f.sp.capsici），供试生防菌为枯草芽孢杆菌Ya-1（B.subtilis），来源于海南五指山热带雨林土壤，其具有广谱抗性，对辣椒枯萎病菌有较好的抑制效果。

1.2 方法

1.2.1 样地概况和根际土壤采集试验土壤采集自健康辣椒土壤，首先将采集的土壤经过80目过筛后，再与营养基质8∶1比例混匀后装盆。使用1%次氯酸钠溶液对‘乾隆一号’感病辣椒种子表面消毒，无菌水冲洗3遍，将种子放置在带有无菌滤纸的120 mm玻璃培养皿，加入无菌水使种子没过滤纸片，保湿催芽5 d，待80%以上的种子露白后，播种到事先准备好的盆中，每盆3颗。待辣椒苗长出2片真叶时，使用1 000倍液的腐殖酸浇灌，4-5 d/次，每次30 mL/盆，连续浇灌3次。保证辣椒苗长势均匀、茁壮。待苗长到6叶1芯时开始处理。

试验共设置4个处理，A: 100 mL无菌水浸根10 min后浇灌；B: 100 mL枯草芽孢杆菌Ya-1发酵液（1×107CFU/mL）浸根10 min后浇灌；C: 100 mL辣椒枯萎病菌（F.oxysporum）孢子悬浮液（1×107CFU/mL）浸根10 min后浇灌；D:先接种100 mL枯草芽孢杆菌Ya-1发酵液，24 h后接种100 mL F.oxysporum孢子悬浮液。分别于接种前、接种后10 d、接种后20 d采集土壤样本，接种前因各盆处理均一致，因而随机取5份样本，每个处理设置5个重复。采集辣椒根放入装有100 mL 0.05 mol/L磷酸缓冲液的250 mL锥形瓶中，晃动锥形瓶充分清洗辣椒根系，13 000 r/min对洗脱液进行离心，高速离心3 min。离心后弃上清，对沉淀土壤多次重复离心洗涤后，将土壤样品收集至离心管，冷冻干燥［16］。冷冻干燥后将根际土壤放入-80℃冷冻箱保存备用。

1.2.2 土壤总DNA提取、PCR扩增和测序每个土壤样品称取0.5 g土样，用FastDNA® Spin Kit for Soil试剂盒提取土壤总DNA。提取的土壤DNA用NanoDrop 2000测定总DNA浓度和纯度。A260/A280值在1.8-2.0之间为合格。将合格样品DNA进行扩增前基因组DNA浓度定量。定量后终浓度稀释为30 ng/μL。以样品DNA为模板，真菌DNA扩增ITS2区引物序列：ITS3-2024F：GCATCGATGAAGAACGCAGC；ITS4-2409R：TCCTCCGCTTATTGATATGC［17］。对PCR产物进行2% 琼脂糖电泳，PCR扩增产物用Qubit4.0荧光计进行定量，然后将产物送至武汉天一华煜公司HiSeq平台进行PE250测序。

1.2.3 数据处理原始下机数据的上游分析主要采用Mothur和usearch完成。其流程主要如下：对原始数据进行严格质控，将小于200 bp的序列进行去除，剔除模糊碱基序列“N”和序列平均质量Q值＜20的低质量序列，最终获得effective tags。利用 Mothur软件包对 tag 序列进行了去冗余处理，小于200 bp的序列被丢弃，从中挑选出 unique tag 序列。用 Uparse 软件对所有样品的全部 Effective Tags 序列聚类，默认提供以97%的一致性将序列聚类成为OTUs（Operational Taxonomic Units）［18］。使用RDP-Classifier软件注释时，采用Fungal ITS（unite database 7.2 version）数据库对真菌OTU代表序列进行序列注释，最终得到OTU代表序列［19］。将OTU表抽平后获得75 514条序列，计算α多样性指数。使用R软件中的Vegan包计算样本间Bray-Cutis距离矩阵。采用主坐标分析方法分析不同处理下各样本微生物群落结构差异。同时，使用R软件中的Vegan包进行非参数多反应置换法、相似性分析和非参数多变量置换法方差分析来鉴定两组间的群落差异［20-21］，对微生物种群进行相关性分析。

1.2.4 土壤微生物共发生模式分析使用抽平的OTU表，取相对丰度排名前500的OTU进行土壤真菌微生物共发生网络构建。利用分子生态网络分析（MENA，http://ieg4.rccc.ou.edu/mena/login.cgi），基于Spearman秩相关矩阵构建了真菌4个类群的系统发育分子生态网络（pMENs），只保留高于特定阈值（真菌：0.82）的相关性来计算网络特征值［22-24］。最后采用Gephi（https://gephi.org/）软件进行网络的可视化操作，得到network网络图，并在Gephi软件里面进行模块化分析。

1.2.5 辣椒枯萎病发病率和防治效果按照参考文献［25］发病情况，并计算辣椒枯萎病发病率以及相对防效。统计方法如下：

2 结果

2.1 拮抗枯草芽孢杆菌Ya-1对辣椒枯萎病发病率和病害指数的影响

辣椒枯萎病的发病率和病害指数结果见表1。结果表明，单独接种病原菌FOC处理（C）第10天和第20天的发病率分别为32.08%和45.83%，而接种Ya-1+FOC处理（D）的发病率分别为7.08%和10.42%。接种Ya-1+FOC处理（D）与单独接种病原菌FOC处理（C）在第10天和第20天的发病率差异极显著（P＜ 0.01，表1），前者比后者发病率分别降低了25%和35.41%。另CK处理（A）和单独接种Ya-1处理（B）在第10和第20天时未见发病植株，仅有少量自然枯死植株（茎基部不变褐色），因而不做防治效果统计。与单独接种病原菌FOC处理（C）相比，接种Ya-1+FOC处理（D）在第10和第20天的相对防治效果分别为77.93%和77.26%。

表1 拮抗菌Ya-1在不同时间点辣椒枯萎病发病率和防治效果Table 1 Incidence rate and control effect of pepper Fusarium wilt with antagonist Ya-1 at different time points

2.2 根际真菌群落α多样性

测序共获得4 639 049条OTU，每个样品OTU数在75 514和149 265之间。经过抽平后所有OTU条数为75 514。对不同处理组和对照组在不同时间点的辣椒根际真菌群落进行α多样性分析，结果如表2。辣椒根际土壤真菌群落的α多样性指数（Shannon指数）和丰富度指数（Chao1）呈不同的变化趋势（表2）。接种枯草芽孢杆菌Ya-1组（B）和对照（A）真菌shannon指数均先升高后降低，接种辣椒枯萎病菌（C）组先降低后升高，同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1和辣椒枯萎病菌组（D）真菌Shannon指数逐渐降低。10 d时接种辣椒枯萎病菌组Shannon指数显著低于对照，接种枯草芽孢杆菌Ya-1组、同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1和辣椒枯萎病菌组与对照无显著差异，同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1和辣椒枯萎病菌组Shannon指数显著高于接种辣椒枯萎病菌组；20 d时接种枯草芽孢杆菌Ya-1组、接种辣椒枯萎病菌、同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1和辣椒枯萎病菌组Shannon指数均与对照无显著差异，同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1和辣椒枯萎病菌组与接种辣椒枯萎病菌组Shannon指数之间也无显著差异。

忽然，十六师第四十六团团长谢士炎电话报告，守西门的连长报告，信安江上游浮来一个老百姓，说有事要见师长。

表2 辣椒根际真菌α多样性指数Table 2 Fungal α diversity indices around pepper rhizosphere soil

接种枯草芽孢杆菌Ya-1组（B）和对照（A）真菌Chao1值均先升高后降低，接种辣椒枯萎病菌（C）组以及同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1和辣椒枯萎病菌组（D）真菌Chao1值均逐渐升高。10 d时接种枯草芽孢杆菌Ya-1组、接种辣椒枯萎病菌、同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1和辣椒枯萎病菌组Chao1值均与对照无显著差异，同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1和辣椒枯萎病菌组与接种辣椒枯萎病菌组Chao1值之间也无显著差异；20 d时接种枯草芽孢杆菌Ya-1组Chao1值均与对照无显著差异，接种辣椒枯萎病菌、同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1和辣椒枯萎病菌组Chao1值显著高于对照，同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1和辣椒枯萎病菌组Chao1值显著高于接种辣椒枯萎病菌组。

2.3 枯草芽孢杆菌Ya-1对辣椒根际真菌群落组成的影响

在门分类水平上，子囊菌门（Ascomycota）、捕虫霉门（Zoopagomycota）和担子菌门（Basidiomycota）在每个接种时间点处理组和对照组土壤样品中均占据真菌群落的优势地位，其相对丰度在36.58%-74.11%，如图1。其中子囊菌门（Ascomycota）在所有处理中均属于优势菌群（相对丰度＞4%）。在第10天时，子囊菌门（Ascomycota）在对照组土壤样品中的相对丰度最低，在接种辣椒枯萎病菌组土壤样品中相对丰度最高（28.79%，66.53%）；20 d时，子囊菌门（Ascomycota）在接种枯草芽孢杆菌Ya-1组土壤样品中的相对丰度最低，同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1和病原菌处理土壤样品中相对丰度最高（26.03%，60.39%）。在10 d时，捕虫霉门（Zoopagomycota）在接种辣椒枯萎病菌组土壤样品中相对丰度最低，接种枯草芽孢杆菌Ya-1组处理土壤样品中相对丰度最高（3.71%，10.09%）；20 d时，捕虫霉门（Zoopagomycota）在同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1和病原菌组相对丰度最低，对照组土壤样品中的相对丰度最高（2.40%，10.70%）。在10 d时，担子菌门（Basidiomycota）在接种病原菌处理土壤样品中相对丰度最低，同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1和病原菌组土壤样品中相对丰度最高（2.98%，4.31%）；20 d时，担子菌门（Basidiomycota）在接种辣椒枯萎病菌组土壤样品中相对丰度最低，接种枯草芽孢杆菌Ya-1处理土壤样品中相对丰度最高（5.09%，6.20%）。

图1 门分类水平上辣椒根际土壤真菌优势种群Fig.1 Dominant fungal population of pepper rhizosphere soil at phylum level

进一步将接种后10 d和20 d的top10真菌属进行了组间差异分析，发现不同处理之间优势菌属群落发生显著变化（图2）。在10 d时，与对照相比，接种枯草芽孢杆菌Ya-1处理土壤样品中被孢霉菌（Mortierella）的相对丰度显著升高（P＜0.05），Boothiomyces、周刺座霉属（Volutella）的相对丰度显著降低（P＜0.05）；接种辣椒枯萎病原菌处理土壤样品中镰刀霉（Fusarium）、木霉属（Trichoderma）的相对丰度显著升高（P＜0.05），Boothiomyces、周刺座霉属（Volutella）的相对丰度显著降低（P＜0.05）；其他组对比均无显著差异。与接种辣椒枯萎病原菌处理相比，同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1和病原菌处理土壤样品中Fusarium的相对丰度显著降低（P＜0.05），被孢霉菌（Mortierella）的相对丰度升高，但差异不显著。在20 d时，与对照相比，接种枯草芽孢杆菌Ya-1处理土壤样品中top10属在两者之间无显著差异；接种辣椒枯萎病原菌处理土壤样品中镰刀菌属（Fusarium）、木霉菌属（Trichoderma）的相对丰度显著升高（P＜0.05）；其他组对比均无显著差异。与接种辣椒枯萎病原菌处理相比，同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1和病原菌处理土壤样品中的被孢霉菌（Mortierella）的相对丰度显著升高（P＜0.05）。

图2 辣椒接种10 d和20 d相对丰度最高的10个真菌属Fig.2 Top 10 fungi genera with the highest relative abundance at 10 d and 20 d

对筛选的相对丰度为1%以上的OTU进行鉴定分析，OTU_1经过NCBI鉴定为病原菌F.oxysporum，其序列与接种病原菌序列相似度在97%以上，在不同处理相对丰度如图3。在10 d和20 d同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1和病原菌处理土壤样品中OTU_1相对丰度显著高于接种辣椒枯萎病原菌处理（P ＜ 0.05）；同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1和病原菌处理土壤样品在10 d时相对丰度显著高于20 d。

图3 OTU_1总相对丰度Fig. 3 Total relative abundance of OTU_1

2.4 辣椒根际土壤真菌群落结构分析

利用基于 Bray_Curtis距离算法 PCoA 分析对辣椒根际土壤真菌群落结构进行分析，结果表明，接种不同时间点土壤真菌的群落结构存在差异，PCoA1和PCoA2共解释了29.7%的变异，其中第一轴和第二轴分别解释了22.8%和6.9%的变异（图4）。基于 Bray_curtis 算法的相似性分析（ANOSIM）结果，0 d与10 d、20 d根际土壤真菌群落结构间具有显著差异（R=0.3198，P=0.001；R=0.2697，P=0.031），10 d和20 d之间差异不显著（R=0.0281，P=0.143）（表3）。基于Bray_curtis 算法的非参数多元统计检验（MRPP和PERMANOVA）与上述结果一致。

图4 辣椒不同时期不同处理根际间真菌群落主坐标分析Fig.4 PCoA analysis of fungal community in pepper rhizosphere at different time points under different treatments

表3 不同时期两组间辣椒根际真菌群落相异性分析Table 3 Dissimilarity test of pepper rhizosphere soil fungal community between two groups at different time points

基于 Bray_curtis 算法的相似性分析（ANOSIM）可知，在10 d时，接种枯草芽孢杆菌Ya-1发酵液处理、接种辣椒枯萎病菌处理和同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1发酵液和辣椒枯萎病菌处理与对照处理的根际真菌群落结构差异显著（R=0.432，P=0.011；R=1，P=0.009；R=0.996，P=0.015）；接种辣椒枯萎病菌处理和同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1发酵液和辣椒枯萎病菌处理根际真菌群落结构也具有显著差异（R=1，P=0.006）。在20 d时，接种枯草芽孢杆菌Ya-1发酵液处理、接种辣椒枯萎病菌处理、同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1发酵液与辣椒枯萎病菌处理与对照处理的根际真菌群落结构差异显著（R=0.256，P=0.029；R=0.528，P=0.01；R=0.684，P=0.01）。接种辣椒枯萎病菌处理和同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1和辣椒枯萎病菌处理根际真菌群落结构也具有显著差异（R=0.604，P=0.007）。此外，基于Bray_curtis 算法的非参数多元统计检验（MRPP和PERMANOVA）进一步表明验证了上述处理之间的差异（表4）。

表4 不同时间点不同处理间辣椒根际真菌群落相异性分析Table 4 Dissimilarity analysis of pepper rhizosphere soil fungal community at different time points among different treatments

2.5 分子生态网络分析

基于不同时期土壤样品500个OTU进行分子生态网络构建，采用快速模块化优化方法对模块进行识别，构建的真菌群落系统发育分子生态网络（pMENs）显示了OTUs之间的相互作用（表5，图5）。处理组和对照组的节点和连接数分别为：A（290，443）、B（292，416）、C（311，406）和D（309，346）。其中，对照组土壤样品拥有最少的节点数和最多的连接数。4个处理的真菌网络均以正相关关系为主（A：77.20%，B：60.10%，C：61.58%，D：54.05%），相比较对照，其他三组的正连接比例更低；相比较接种辣椒枯萎病菌处理，同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1和辣椒枯萎病原菌处理的正连接比例更低。接种枯草芽孢杆菌Ya-1和接种辣椒枯萎病菌处理的平均度低于对照；同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1和辣椒枯萎病原菌处理的平均度低于接种辣椒枯萎病菌处理。

表5 不同处理下真菌种群的经验网络和随机网络性质Table 5 Empirical network and random network properties of fungal populations under different treatments

同时分析4个处理的经验网络，相比较对照，接种枯草芽孢杆菌Ya-1和接种辣椒枯萎病菌处理的平均路径距离、平均聚类系数和模块化值更高；相比较接种辣椒枯萎病菌处理，同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1和辣椒枯萎病原菌处理的平均聚类系数更低，平均路径距离和模块化值更高（表5）。对随机网络进行分析，相比较对照，接种枯草芽孢杆菌Ya-1组和接种辣椒枯萎病菌处理的平均聚类系数更低，平均路径距离和模块化值更高；相比较接种辣椒枯萎病菌处理，同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1和辣椒枯萎病原菌处理的平均聚类系数更低，平均路径距离、模块化值更高（表5）。

3 讨论

辣椒枯萎病是由尖孢镰刀菌侵染引起的一类顽固性土传病害，梁建根等［26］研究表明，生防菌株B-3枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的发酵液及其滤液对辣椒枯萎病的盆栽与大田试验的防效分别为73.6%和64.8%，显著优于100 mg/L多菌灵，对辣椒枯萎病菌均表现出较好的抑制作用。郭珺等［11］发现芽孢杆菌Pb-4菌株对辣椒、番茄、黄瓜枯萎病及辣椒疫霉病等具有较好的防效。本研究中与单独接种辣椒枯萎病菌的处理（C）相比，复合接种的Ya-1+FOC处理（D）在10 d和20 d的防治效果分别为77.93%和77.26%（表1），表明枯草芽孢杆菌Ya-1 对辣椒枯萎病同样具有较好的防治效果。其盆栽防效甚至高于梁建根等［26］对生防枯草芽孢杆菌B-3的报道。究其因可能与不同来源的菌株活性差异、对周围生物和非生物环境等的影响，尤其是土壤微生物组的影响有关。

土壤微生物组在调控植物生长、抗逆、抗病等方面起重要作用，微生物组受植物种类以及植物生长状态影响［27-28］。受到生物和非生物胁迫后，植物可通过调整根际微生物组而缓解胁迫所造成的危害［29］。本研究中，接种枯草芽孢杆菌Ya-1处理组和对照真菌香农指数均先升高后降低，而接种辣椒枯萎病菌组先降低后升高，同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1和辣椒枯萎病菌组真菌香农指数均逐渐降低，同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1和辣椒枯萎病菌组真菌α多样性在10 d和20 d时真菌香农指数均高于接种辣椒枯萎病菌组，该结果表明单独接种枯草芽孢杆菌Ya-1处理对真菌α多样性指数的影响较小，在接种辣椒枯萎病菌后同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1能有效降低根际真菌α多样性。

核心微生物组是影响植物生长、稳定微生物组的关键组成，只有改变核心微生物组，才能彻底改变根际微生物组的群落结构［27］。芽孢杆菌作为一类有益微生物菌群，可以产生多种抑菌活性物质，抑制病原菌的生长，提高植物的抗病能力，有些芽孢杆菌具有解磷、固氮和产生植物激素的能力，通过改变微生物组的结构可影响植物的生长和抗逆性［11,13,15］。Qiao等［30］研究发现，外源施用生防枯草芽孢杆菌可以短暂改变番茄根际微生物组。樊祖清等［31］研究表明，施用解淀粉芽孢杆菌菌剂改善了烟田土壤微生物结构，增加了有益菌数量，尤其是鞘氨醇单胞菌属的数量，促进烟株吸收根际土壤营养、释放根际分泌物。本研究发现相比较接种辣椒枯萎病菌组，同时接种辣椒枯萎病菌和枯草芽孢杆菌Ya-1组中被孢霉属相对丰度均升高，而被孢霉属其中一些有益菌可能与植物形成共生关系［32-33］，对于改善土壤性质、促进植物的生长起一定的作用，该结果表明在辣椒枯萎病发病后添加枯草芽孢杆菌Ya-1后提高了土壤中有益菌数量。本研究在辣椒枯萎病病原菌Fusarium oxysporum和生防菌枯草芽孢杆菌Ya-1处理 10 d和20 d 后分析了辣椒根际土壤真菌群落结构，发现接种外源菌株处理后对根际微生物的结构影响较大。通过基于Bray-Curtis距离对不同处理的辣椒根际土壤真菌群落组成进行PCoA分析，发现接种前处理和接种10 d、20 d处理真菌群落组成距离较远，接种10 d、20 d相聚较近，同时相异性分析也展示相同的结果，该结果表明在进行处理后真菌群落组成发生了显著变化，但是接种10 d、20 d样品整体差异较小。分别比较接种10 d和20 d处理组和对照组真菌群落，同一时间点处理组和对照组真菌群落具有显著差异，接种辣椒枯萎病菌组和同时接种辣椒枯萎病菌和枯草芽孢杆菌Ya-1组也具有显著差异，该结果表明接种辣椒枯萎病菌组和枯草芽孢杆菌Ya-1均能改变辣椒根际真菌群落，而在接种辣椒枯萎病原菌后接种枯草芽孢杆菌Ya-1也改变了接种辣椒枯萎病菌组辣椒根际真菌群落。

对不同处理根际土壤真菌群落结果分析表明，在该试验中，各处理土壤优势种群分别为子囊菌门（Ascomycota）、接合菌门（Zygomycota）、担子菌门（Basidiomycota）。与单接辣椒枯萎病菌相比，同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1和病原菌在10 d时均提高了捕虫霉门（Zoopagomycota）和担子菌门（Basidiomycota）的相对丰度，降低了子囊菌门（Ascomycota）的相对丰度；在20 d时，提高了子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）的相对丰度，降低了捕虫霉门（Zoopagomycota）的相对丰度。子囊菌门是主要优势菌门，有研究表明子囊菌门引起植物病害，多引起根腐、茎腐、果（穗）腐、枝枯和叶斑等症状［34］，在该试验中不同处理子囊菌门相对丰度为26.03%-66.53%，占主导地位。担子菌多为土壤腐生真菌, 在土壤木质素含量较高的环境中为优势菌, 是复杂化合物及有机质的重要分解者，在养分循环中担任着重要角色［35-36］。担子菌可高效分解木质化植被碎屑，其滑锈伞属（Hebeloma）、丝膜菌属（Cortinarius）可与植物共生形成菌根，增强植株抗性［37-38］。

尖孢镰刀菌是最重要的植物病原真菌之一，可引起多种植物发生病害［39-41］，同时也是引发辣椒枯萎病的病原菌。本研究中，相比较对照（A），接种辣椒枯萎病菌处理（C）后连接数减少，而在加入枯草芽孢杆菌Ya-1处理后，节点数变化较小，但是正连接数降低，表明同时接种枯草芽孢杆菌Ya-1和辣椒枯萎病原菌处理（D）降低了真菌群落的复杂度。同时在10 d和20 d，OTU_1（NCBI鉴定为本实验接种病原菌菌F.oxysporum）相对丰度在接种辣椒枯萎病原菌组和同时接种辣椒枯萎病菌组和枯草芽孢杆菌Ya-1组间具有显著差异，相比较接种辣椒枯萎病原菌组，OTU_1相对丰度在10 d和20 d时分别降低了19.03%和6.99%，该结果表明同时在接种辣椒枯萎病菌组后接种枯草芽孢杆菌Ya-1显著降低了根际土壤中病原菌F.oxysporum的相对丰度，并且在10 d时效果更加显著。表明施枯草芽孢杆菌菌剂后有益真菌比例增加，病原菌比例减少，驱动了真菌群落的生态演替，降低了真菌群落多样性，进而导致土壤中镰刀菌丰度显著下降，有效防控辣椒枯萎病发生。