类胡萝卜素降解菌株的原位筛选及其在雪茄提质增香中的应用

吴巧茵 施友志 李林林 彭政 谭再钰 刘利平 张娟 潘勇

（1.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122；2.江南大学生物工程学院，无锡 214122；3.江南大学未来食品科学中心，无锡 214122；4.湖北中烟工业有限责任公司，武汉 430040）

类胡萝卜素是雪茄烟叶（Nicotiana tabacum）质体色素的重要组成部分，包括叶黄素、β-胡萝卜素、番茄红素和新叶黄素等，常见的类胡萝卜素降解产物包括β-紫罗兰酮、柠檬醛、二氢猕猴桃内酯、β-大马酮等［1］，不仅香气阈值低、香气芬芳，是常用的烟用香精成分，还具有抗炎症、抗氧化、清除强自由基活性等药理潜能，在食品、化妆品和香水中的应用也十分广泛［2-4］。类胡萝卜素的降解方式主要为物理降解、化学降解和生物降解，物理降解以光降解和热降解为主，降解较为缓慢、难以控制。目前工业生产类胡萝卜素降解产物通常采用化学降解法，但化学试剂的大量使用对于环境的污染较大，且废水处理成本较高。生物降解法较为安全，从烟叶中获得的微生物来源较为可靠，在工业生产中使用较为便利［5］。

近年来有关烟叶来源的类胡萝卜素降解菌株的研究较少，主要以分离筛选烟叶表面微生物为主，其中杨雪鹏等［6］获得了一株美洲爱文氏菌（Ewingella americana），对叶黄素降解率最高可达90.02%；龙章德等［7］发现一株西方许旺酵母（Schwanniomyces occidentalis）可降解β-胡萝卜素，增加烟叶二氢猕猴桃内酯、橙花基丙酮等物质含量。烟叶内生菌不仅种类多且具有与菌群和宿主互作、降碱增香等功能，还有食品安全性的优势，具有巨大的经济前景和科学研究价值［8］。例如，陈颐等［9］发现2株内生细菌黄色气微菌（Aeromicrobium flavum）和嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）分泌氧化酶活性较高并能使烟叶类胡萝卜素降解速度加快；袁涛［10］通过分析一株根瘤菌属（Rhizobium）W44T的代谢通路，发现其具有合成类胡萝卜素的潜能。但由于内生菌具有难以培养、丰度低且生长十分缓慢等特质，目前仍有大量内生菌资源未被发现［8,11］。近年来高通量筛选和原位培养技术的迅速发展，通过模拟烟叶微生物生长环境可获得少量难以培养的微生物，利用类胡萝卜素在400-500 nm具有最大吸收的特性，从优质雪茄烟叶中原位培养并大量筛选可降解类胡萝卜素内生菌的可行性增加［12-14］。

本研究结合原位培养和流式细胞分选技术，从雪茄烟叶中原位筛选可降解类胡萝卜素的内生菌，将其应用于来凤CX81中部二级烟叶中发酵，并对发酵烟叶的类胡萝卜素降解产物含量和感官质量进行分析，旨在为雪茄工业微生物菌剂的制备和烟叶内生菌资源的挖掘提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料 湖北来凤CX81中部二级烟叶原料用于原位培养烟叶内生菌和烟叶发酵，由湖北中烟工业有限责任公司提供，烟叶香气质中等、香气量一般、刺激性较大；湖北十堰CX14中部一级烟叶、厄瓜多尔E-HABANA 2 000上部烟叶和多米尼加CRIOLLO 98上部烟叶用于筛选可降解β-胡萝卜素的微生物，香气质较好、香气量较足、烟香较丰富，由湖北中烟工业有限责任公司提供。

1.1.2 试剂 β-胡萝卜素97%，购自上海源叶生物科技有限公司；蛋白胨、酵母粉、氯化钠等试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3 微量元素培养基 含Na2HPO4·12H2O 6.15 g/L、KH2PO41.52 g/L、(NH4)2SO40.5 g/L、Mg-SO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl2·2H2O 0.05 g/L、微量元素溶液I 10 mL/L。其中，微量元素溶液I：EDTA 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.2 g/L、微量元素溶液II 100 mL/L；微量元素溶液II：ZeSO4·7H2O 0.1 g/L、MnCl2·4H2O 0.03 g/L、 H3BO30.3 g/L、CoCl2·6H2O 0.2 g/L、CuCl2·2H2O 0.01 g/L、NiCl2·6H2O 0.02 g/L、Na2MoO4·2H2O 0.03 g/L。培养基成分配制参考文献［15］。

1.1.4 富集培养基 β-胡萝卜素作为唯一碳源，按照5 g/L的含量加入微量元素培养基，可富集原位培养微生物中可降解β-胡萝卜素的菌株。

1.1.5 LB培养基 蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化钠 10 g/L，LB固体培养基中琼脂按照15 g/L含量添加。

1.1.6 复筛培养基 蛋白胨10 g/L、氯化钠10 g/L、β-胡萝卜素5 g/L。

1.1.7 主要仪器 电子天平EX124ZH（奥豪斯仪器（常州）有限公司），恒温培养箱BXP-450（上海博讯实业有限公司），恒温恒湿培养箱BXS-400S（上海博讯实业有限公司），恒温振荡摇床ZQZY-CF（上海知楚有限公司），孔板离心机CR21N（天美创科仪器有限公司），孔板摇床ZQZY-3cs8H（上海知楚有限公司），酶标仪Cytation 3（美国Biotek公司），三重四级杆气质联用仪TSQ8000（赛默飞世尔科技有限公司），流式细胞分选仪BD FACSArica III（美国BD公司）等。

1.2 方法

1.2.1 烟叶微生物原位培养 取优质烟叶样品10 g于500 mL带挡板三角瓶，加入75%乙醇至浸没烟叶，于10℃、220 r/min振荡10 min。表面消毒后的烟叶使用无菌水冲洗3次，烟叶样品使用液氮充分研磨促进内生菌的释放，将研磨的粉末添加入20 g/L CX81烟叶的90 mL LB培养基中，于37℃或30℃、220 r/min条件下振荡培养48 h，厌氧微生物的原位培养需置于二氧化碳培养箱，培养48 h即可获得烟叶原位培养微生物。

1.2.2 富集培养 将原位培养液按照1%、2%、5%（体积分数）接种量分别加入添加20 g/L烟叶的富集培养基中，富集具有降解类胡萝卜素功能的内生菌，富集培养条件设置为30℃、37℃，转速为220 r/min，培养24 h。富集培养后于4 000 ×g离心10 min收集菌体沉淀。

1.2.3 流式细胞分选 采用PI染液分选富集培养物中的活细胞，PI染色浓度和染色时间参考［16］，使用PBS重悬菌体沉淀并多次清洗菌体，最终调节菌体浓度为OD600=0.1-0.2。用1 mL PI染液于4℃避光孵育15 min，富集培养物中的活细胞将被分选到装有200 μL富集培养基的96浅孔板中，30℃或37℃、170 r/min培养72 h。将初步分选具有类胡萝卜素降解能力（发酵液颜色变浅或发酵液OD495较空白对照小）的菌株接种到装有800 μL复筛培养基的96深孔板中，30℃或37℃、170 r/min培养72 h，12 000×g离心2 min取发酵上清液检测发酵液OD495和观察发酵液颜色，可筛选获得高效降解类胡萝卜素的菌株，将获得的菌株进行划线纯化。β-胡萝卜素降解率的计算以未接种活细胞的孔板为空白对照，β-胡萝卜素降解率（%）=（空白对照-菌株发酵上清液）/空白对照×100%。

1.2.4 菌种鉴定 菌株采用16S rDNA测序进行分子鉴定，引物为通用引物27F和1492R，PCR反应程序和反应体系参考文献［17］。

1.2.5 烟叶发酵 以湖北中烟工业有限责任公司提供的湖北来凤CX81中部二级烟叶为样品，取200 g烟叶于自封袋中，菌株接种至LB培养基中37℃、220 r/min培养24 h，培养至菌液OD600为1，按照2%接种量均匀喷洒到烟叶表面并使得烟叶最终含水量为28%，室温回潮一夜后于37℃、湿度为70%恒温恒湿培养箱中发酵20 d。以添加相同体积无菌水的烟叶作为对照，标记为CK。

1.2.6 发酵烟叶感官质量分析 烟叶样品的感官评价由湖北中烟工业有限责任公司进行，按照1-5分对样品的香韵、定性指标和定量指标进行打分，不存在记0分。香韵类型包括：木香、豆香、花香、蜜甜香、醇甜香、焦甜香、清甜香、花粉香、奶香、干草香、烘焙香、树脂香、果香、药草香、坚果味、皮革味、咖啡味、胡椒味。定性指标分为：苦、甜、咸、辣、涩。定量指标分为：烟气浓度、烟气强度、透发性、醇和度、雪茄风格彰显度、香气质、香气量、杂气、刺激性、余味、甜润感、燃烧性、灰色。质量得分按照公式进行计算：质量得分=（香气质×0.18+香气量×0.16+杂气×0.10+刺激性×0.12+余味×0.16+甜润感×0.10+燃烧性×0.10+灰色×0.08）/5×100。

1.2.7 发酵烟叶类胡萝卜素降解产物测定 采用顶空-固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术（HSSPME/GC-MS），对发酵质量得分较高的烟叶进行烟叶类胡萝卜素降解产物测定，SPME纤维组件二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷作为萃取头，发酵结束的烟叶在40℃低温烘干并研磨成粉末，取1.5 g烟叶粉末于顶空瓶中，添加2-辛醇作为内标，浓度为100 μg/μL。氦气流速为1 mL/min，烘箱温度固定为40℃保持2 min，在15℃/min下升温至250℃并保持5 min，离子源温度为210℃，传输线温度为280℃。HS-SPME/GC-MS程序和类胡萝卜素降解产物分析方法参考文献［18-19］。

2 结果

2.1 β-胡萝卜素降解菌株的原位筛选

优质雪茄烟叶内生菌经原位培养、富集培养后，使用流式细胞分选技术分离烟叶内生菌，具体流程如图1所示，从富集培养物中共分选480个菌株，如图2所示，初筛得到42株具有β-胡萝卜素降解能力的菌株，其中复筛后有21株菌株β-胡萝卜素降解率在50%以上，降解率在80%以上的菌株按照由高到低的排序为2B1＞2B2＞1D3＞C31＞C7＞1F9＞2E5＞C42＞A71。

图1 β-胡萝卜素降解菌株的原位筛选Fig.1 In situ screening of β-carotene-degrading strains

图2 菌株β-胡萝卜素降解率Fig.2 β-carotene degrading rates of strains

对具有较好β-胡萝卜素降解能力的21株菌株进行菌种鉴定，结果发现筛选得到的菌属包括农杆菌属（Agrobacterium）、根瘤菌属（Rhizobium）、鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）、肠杆菌属（Enterobacter）、不动杆菌属（Acinetobacter）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、微杆菌属（Microbacterium）、芽孢杆菌属（Bacillus）、布氏杆菌属（Brucella）和肠球菌属（Enterococcus），共10个属（图3）。

图3 菌株系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of strains

2.2 发酵烟叶感官质量分析

将21株具有较好β-胡萝卜素降解能力的菌株进行雪茄烟叶发酵实验，并对发酵结束的烟叶进行感官质量分析，共有8株β-胡萝卜素降解菌株发酵烟叶质量得分高于CK（表1）。结果表明，菌株C31、C11、H4发酵烟叶质量得分明显高于CK，香气质、香气量、刺激性等各项指标有较好的提升。其中C31香气丰富度较好，香气质、香气量明显优于CK，烟气刺激性明显下降；C11较CK香气丰富度提升，香气量充足，烟气刺激性、杂气较轻；H4烟叶刺激性和余味指标提高，杂气略有减轻；A5、F5、A72等菌株减轻了烟叶杂气、刺激性，改善了余味、燃烧性等指标。

表1 发酵烟叶质量得分Table 1 Quality score of fermented tobacco leaves

以雷达图表征质量得分较高的C31、C11和H4发酵烟叶定性指标、定量指标和香韵类型（图4）。发酵烟叶C31、C11和H4香韵类型多于CK，主要表现为C31烟叶共有9种香韵类型，木香、坚果味较为突出，还辅以豆香、烘焙香、蜜甜香等香韵；C11木香最为突出，花香较为明显，并辅以树脂香、干草香、焦甜香等香韵，共有8种香韵类型；H4木香、豆香和焦甜香较为突出，辅以坚果味、药草香等香韵，共有9种香韵类型。从烟叶定性指标和定量指标可以看出，菌株C31、C11、H4发酵烟叶辣味、涩味减轻，甜味增加，烟气醇和度、透发性提升，烟叶感官质量得到明显的改善。以上结果说明类胡萝卜素降解菌株C31、C11、H4能够增加国产烟叶香韵类型，提升醇和度和透发性，实现了雪茄烟叶的提质增香。

图4 发酵烟叶感官质量雷达图Fig.4 Radar chart of sensory quality of fermented tobacco leaves

2.3 发酵烟叶类胡萝卜素降解产物变化

对感官质量较好的C31、C11、H4发酵烟叶进行类胡萝卜素降解产物测定，结果如图5和表2所示，C31、C11、H4发酵烟叶中类胡萝卜素降解产物含量显著增加，分别是CK的1.38、1.28、1.43倍，表明菌株接种烟叶发酵能够促进烟叶类胡萝卜素降解。其中，菌株强化发酵烟叶中法尼基丙酮、甲基庚烯酮、香叶基丙酮、六氢假紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯等物质含量增加。不同菌株发酵烟叶中类胡萝卜素降解产物差异较大，C31烟叶法尼基丙酮含量最高，橙化基丙酮、香叶基丙酮、甲基庚烯酮含量较高；C11香叶基丙酮含量最高，巨豆三烯酮含量也明显高于C31和H4；H4烟叶中类胡萝卜素降解产物种类最多，橙化基丙酮和甲基庚烯酮含量最高，二氢猕猴桃内酯含量略低于C31和C11。

表2 发酵烟叶类胡萝卜素降解产物Table 2 Carotenoid-degraded products in fermented tobacco leaves

图5 发酵烟叶类胡萝卜素降解产物含量Fig.5 Content of carotenoid-degraded products in fermented tobacco leaves

3 讨论

3.1 烟叶内生菌的原位筛选

烟叶内生菌广泛存在于烟叶根际、茎、叶，因其丰富的多样性及抗病虫害、促进烟草生长、降低有害物质等特点成为行业研究的重要方向，但目前仍主要采用传统平板分离技术进行内生菌筛选［8,20-21］。烟叶中包含的信号分子、关键酶、蛋白及电子供体或受体等某些关键营养物质可促进烟叶内生菌的生长，但由于烟叶化学成分复杂，难以对烟叶内生菌生长繁殖的自然条件进行模拟［11,22］。本研究将20 g/L的烟叶加入原位培养基，同时β-胡萝卜素作为富集培养基的唯一碳源，提供较匮乏的营养物质，适合培养具有降解β-胡萝卜素能力且生长缓慢的内生菌。

流式细胞术在烟草中的研究相对于其他植物较少，主要应用于烟气细胞毒理学分析、烟草原生质体分析、检测烟草青枯菌密度等［23］；流式细胞分选技术作为目前较为广泛使用的一种高通量筛选技术，Zheng等［24］基于一种羰基的特异性荧光探针建立了一套细胞分选方法，标记并分选出产羰基化合物的菌株，说明流式分选技术可应用于烟叶微生物的筛选。本研究通过原位筛选得到21株具有较好β-胡萝卜素降解能力的菌株，包括农杆菌属、根瘤菌属、鞘氨醇杆菌属、肠杆菌属、芽孢杆菌属等，这些菌属在已有研究中报道为烟叶内生菌或根际微生物中常见的菌属，通常具有促进烟草生长、增加烟叶香气、可降解烟碱等有害物质等作用［8,20,25-26］。以上结果表明，本研究中原位培养和富集培养的培养基和条件适合生长缓慢的微生物和内生菌的培养，与现代筛选技术相结合可实现烟叶特定功能内生菌的高通量、高效、靶向筛选。

3.2 类胡萝卜素降解菌株及降解产物对烟叶品质的影响

类胡萝卜素降解产物是烟叶香气组成和影响烟叶品质的重要物质，刘晶等［27］研究表明国外产地雪茄烟中甲基庚烯酮、巨豆三烯酮、法尼基丙酮等类胡萝卜素降解产物含量较高，这使得国外雪茄烟叶在烟气浓度、丰满度和醇和度等方面优于国产雪茄烟叶，与本研究中烟叶醇和度提升的结果相似［1,27-28］。因此通过接种类胡萝卜素降解菌株促进烟叶类胡萝卜素的降解，可作为提升国产雪茄烟叶香气和品质的技术手段。但目前雪茄烟叶中类胡萝卜素降解菌株的筛选和应用鲜有报道，龙章德等［7］从烤烟鲜叶中分离到一株肠杆菌属可高效降解β-胡萝卜素，产物为β-紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯、β-环柠檬醛等物质；蔡文等［17］筛选到一株高斯芽孢杆菌高产蛋白酶，加入烤烟发酵烟叶类胡萝卜素降解产物含量明显提高。本研究筛选的菌株C31、C11和H4应用于国产雪茄发酵，烟叶类胡萝卜素降解产物含量分别为CK的1.38、1.28、1.43倍，法尼基丙酮、甲基庚烯酮、香叶基丙酮、六氢假紫罗兰酮、二氢猕猴桃内酯等物质增加，增强了烟叶烘焙香、清甜香、花香和木香等香韵，表明类胡萝卜素降解菌株应用于国产雪茄能改善烟叶质量、提升烟叶香气。

王玉华等［26］研究发现香叶基丙酮、法尼基丙酮、二氢猕猴桃内酯与焦甜香显著正相关，其中法尼基丙酮与香气质正相关；巨豆三烯酮与干草香、正甜香显著正相关，具有温和甜润的木香、玫瑰花香味；甲基庚烯酮与清甜香显著正相关，能够较好地提升香气质。本研究中C31烟叶法尼基丙酮含量最高，橙化基丙酮、香叶基丙酮、甲基庚烯酮含量较高，与烟叶木香、烘焙香、甜味的增强和香气质的增加相符；C11香叶基丙酮含量高于C31和H4，使发酵烟叶花香明显增强，巨豆三烯酮增强了烟叶干草香、木香香韵，以上结果与王鹏泽等［28］的研究结果相似。二氢猕猴桃内酯含量与烟叶香气量正相关，这可能是C31、C11香气量较H4改善较为明显的原因，与姜慧娟等［29］的研究相似。茅中一等［30］研究发现，香叶基丙酮具有清甜香和花香、二氢猕猴桃内酯具有清香、甲基庚烯酮具有清香和果香，与本研究结果相似；且甲基庚烯酮、香叶基丙酮阈值较低，这表明通过增加香叶基丙酮、甲基庚烯酮等物质含量能够强化烟叶花香和清甜香，这有助于特征香韵雪茄的定制。本研究对功能菌株强化发酵提升雪茄及其他发酵产品特征香韵提供了技术基础和可借鉴的研究思路。

从发酵烟叶感官质量看，并非类胡萝卜素降解能力越好、类胡萝卜素降解产物含量越高则烟叶香韵和感官质量得分越高，可能是因为内生菌难以在接种烟叶表面存活或受菌群间相互作用的影响使得烟叶感官质量一般，且烟叶致香物质含量、比例和香韵组成的复杂性导致不同烟叶感官质量存在一定的差异［13,31］。除类胡萝卜素降解产物增加外，烟叶感官质量改善可能与烟叶其余化学成分相关，如陈伦旺［32］从烟叶表面微生物中分离出一株假单胞菌属（Pseudomonas）不具备类胡萝卜素降解能力，但发酵烟叶中类胡萝卜素降解产物含量增加。此外，枯草芽孢杆菌311（Bacillus subtilis）和弯曲芽孢杆菌117（Bacillus flexus）除类胡萝卜素降解能力外，还分别能够产蛋白酶和淀粉酶，使发酵烟叶总氮和烟碱含量变化。因此，类胡萝卜素降解内生菌C31、C11和H4对于烟叶原生菌群和化学成分的影响有待进一步研究。

4 结论

本研究从优质烟叶中共获得了21株具有较好的类胡萝卜素降解能力的内生菌，其中C31、C11、H4烟叶类胡萝卜素降解产物含量显著提升，分别提高了1.38、1.28、1.43倍，法尼基丙酮、巨豆三烯酮、香叶基丙酮等类胡萝卜素降解产物含量增加。烟叶焦甜香、木香、花香等香韵增强，香气质提升、香气量足、刺激性降低、杂气减轻，烟叶感官质量得到明显改善。