水稻幼苗酵母单杂文库构建及LAZY1上游调控因子筛选

2023-10-25黄小龙孙贵连马丹丹闫慧清

生物技术通报 2023年9期

黄小龙孙贵连马丹丹闫慧清

（1.贵州师范大学生命科学学院，贵阳 550025；2.贵州省植物生理与发育调控重点实验室，贵阳 550025；3.西南喀斯特山地生物多样性保护国家林业和草业局重点实验室，贵阳 550025）

在悠久的人工选择驯化过程中，水稻（Oryza Sativa L.）的株型生长习性由野生稻的散生生长到如今栽培稻的直立生长，分蘖角的改变大大提高了产量，使水稻成为了一种重要的粮食作物［1］。LAZY1是最早发现的控制水稻分蘖角的基因［2］。水稻lazy突变体已广泛研究了数十年，现更名为lazy1［3-5］。当水稻地上部分完全丧失向重性响应后，植株表型为散生或匍匐生长，人们形象地将控制这种表型的基因命名为“LAZY”。水稻lazy1突变体的地上部向重性丧失，植株表现为散生生长，分蘖角大于50°，细胞学结果显示其胚芽鞘和叶鞘中有正常淀粉体，但生长素的不对称分布受损，进一步研究表明LAZY1通过调控地上部分茎中生长素横向的极性运输，从而抑制植物的向重性响应［6］。LAZY1在不同的植物中功能保守，在大麦（Hordeum vulgare）、玉米（Zea mays）、短柄草（Brachypodium distachyon）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）等植物中均鉴定到了LAZY1的同源基因［7-12］。

水稻LAZY1在胚芽、未伸长茎维管束的外周细胞、叶鞘枕部及茎鞘维管束内侧细胞中特异表达［8］。这种表达方式受LAZY1启动子上的特定顺式元件和相应的转录因子的共同调控［13］。在玉米ZmLAZY1启动子中共鉴定得到4个生长素响应元件和14个光响应元件，生长素和黑暗处理均可诱导玉米ZmLAZY1的表达［12］。水稻LAZY1在黑暗处理下的表达也明显高于光照处理下的表达［2］。目前对于调控LAZY1基因的上游转录因子知之甚少，前期研究仅发现水稻中转录因子热激蛋白OsHSFA2D是LAZY1的上游调控因子［13］，因此对于LAZY1的表达调控仍然是个谜。

本研究通过构建水稻萌发3 d的酵母单杂交文库，以LAZY1启动子为诱饵对该酵母单杂交文库进行筛选，结合双荧光素酶实验验证，得到了结合LAZY1启动子并正调控LAZY1表达的转录因子OsMBF1，为进一步揭示LAZY1的表达调控网络提供了理论基础，有助于揭示水稻由散生变为直立生长的奥秘。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料酵母菌株AH109和Y187保存于本实验室。将酵母菌株划线接种于YPDA固体培养基，30℃，250 r/min恒温摇床培养4-7 d后待用。水稻种子置于MS培养基中无菌培养。

1.1.2 试剂 Library Construction Screening试剂盒（Clontech, Cat.No.630490）, TRIzol Reagent（Invitrogen,Cat.No.15596-018）, Dual-Luciferase®Reporter Assay System试剂盒（Promega, Cat.No.E1910），SMART试剂盒（Clontech, Cat.No.634925），NucleoSpin RNA试剂盒（MNG, Cat.No.740955.50），Mate &PlateTM试剂盒（Clontech, Cat.No.630490），酵母质粒DNA提取试剂盒（TIGEN, Cat.No.DP112）。载体pMD19-T、大肠杆菌DH5α感受态细胞、T4连接酶、EcoR I和Mlu I等酶均购自TaKaRa公司。引物合成及测序由上海生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 水稻LAZY1基因启动子的克隆及序列分析通过RAPDB（http://rapdb.dna.affrc.go.jp/tools/dump）数据库获得LAZY1基因转录起始位点上游1 000 bp序列。以日本晴（Oryza sativa L.ssp japonica cv Nipponbare）的DNA为模板，以LAZY1-F和LAZY1-R引物（表1）进行PCR扩增，扩增产物经电泳、切胶回收后连接至pMD19-T载体。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含50 mg/L氨苄的固体LB培养基，37℃过夜培养，挑取单克隆，选取PCR验证为阳性的单克隆菌株送上海生物工程有限公司进行测序。利用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在线数据库对LAZY1启动子上的顺式作用元件进行分析。

表1 本实验中所用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 诱饵载体pHIS2-LAZY1的构建及转化将LAZY1启动子片段和pHIS2载体分别用EcoR I和Mlu I进行双酶切，酶切产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后回收，纯化然后用T4连接酶连接。按上述T载克隆方法获得阳性重组克隆，将重组质粒送上海生物工程技术公司测序，获得pHIS2-LAZY1诱饵载体。以LiAc热激转化法将诱饵载体pHIS2-LAZY1转化进入AH109酵母菌株［14］，转化后的酵母菌株涂布于SD/-Trp培养基，30℃倒置培养3 d，通过菌落PCR筛选得到pHIS2-LAZY1诱饵菌株。

1.2.3 诱饵载体的自激活检测分别将pHIS2-LAZY1诱饵表达载体转入酵母菌株AH109，pGADT7空载体入酵母菌株Y187，按照Mate&PlateTM试剂盒，30℃，30-40 r/min接合约20 h后收集菌体，涂布于氨基酸营养缺陷型SD/-His/-Leu/-Trp/（SD-LTH）的固体培养基上。如果在上述缺陷型SD-LTH平板的固体培养基上生长，在筛库时需加入组氨酸抑制剂3-氨基-1,2,4-三唑（3-Amino-l, 2, 4-triazole, 3-AT）以抑制组氨酸His泄露。因此，分别在培养基中加入0、20和40 mmol/L的3-AT观察接合菌的生长，以确定最适合的3-AT浓度。同时分别以pHIS2-p53+AD53、pHIS2+AD53和pHIS2+AD作为阳性对照、阴性对照和空白对照。

1.2.4 cDNA文库的构建和转化利用Trizol抽提日本晴萌发3 d幼苗的总RNA，经NucleoSpin RNA试剂盒分离获得mRNA，接着使用SMART试剂盒反转录合成First-Strand cDNA后，经LD-PCR得到双链cDNA，使用CHROMA SPINTMTE-400 Column纯化后得到双链cDNA文库，接着同样利用LiAc热激转化法将5 μg的cDNA文库和3 μg的pGADT7-Rec载体共转化入酵母菌株Y187，将上述悬浮酵母细胞液（预留50 μL用于检测酵母库容和重组率）涂布SD-Leu平板培养3-5 d后, 4℃放置3-4 h，以文库保存培养基收集酵母菌落，重悬离心，加入200 mL文库保存培养基重悬，1.5 mL离心管分装，每管1 mL，得到酵母单杂文库菌，-70℃保存。同时共转化pGADT7-Rec和SV40大T PCR片段作为阳性对照，单独转化pGADT7-Rec空载体作为阴性对照，将上述预留的50 μL酵母悬浮液分别稀释到1∶10和1∶100，取100 μL后分别涂到SD-Leu培养基平板上，培养3-5 d后，选取适合稀释浓度的平板，计算文库筛选克隆数，文库筛选克隆数=培养基（CFU/mL）×稀释倍数×重悬体积。

1.2.5 酵母单杂交文库筛选挑取含有pHIS2-LAZY1诱饵菌株单克隆至50 mL YPDA液体培养基，30℃，250 r/min恒温摇床培养至OD值至0.8，700×g离心5 min后收集菌体，将50 mL pHIS2-LAZY1诱饵菌和1 mL的酵母单杂文库菌混合后加入到100 mL 2×YPDA培养基中，30-50 r/min，30℃，接合约20 h，完成酵母单杂筛库。取100 mL接合菌液分至2个50 mL离心管中，1 000 ×g室温离心10 min，弃上清液。然后再加入2×YPDA洗酵母细胞，1 000×g室温离心10 min，弃上清液。用灭菌水清洗酵母细胞后，两管合并，1 000 ×g室温离心10 min，弃上清液。加入约15 mL灭菌超纯水重悬酵母细胞，取100 μL涂布于SD-LTH/40 mmol/L 3-AT培养基平板，30℃倒置培养4-6 d。

1.2.6 阳性克隆的检测和质粒提取挑取上述SDLTH/40 mmol/L 3-AT培养基上的接合菌的单克隆，以T7和AD引物（表1）进行菌液PCR，电泳检测得到的阳性接合菌株，以酵母质粒DNA提取试剂盒提取质粒，将质粒送至上海生物工程有限公司测序。测序结果在水稻的全基因组数据库进行blast比对，筛选得到LAZY1候选上游因子的基因ID和CDS全长序列。

1.2.7 酵母单杂验证将LAZY1基因的启动子序列经Sac I和Sma I酶切后，与经相同酶切的pAbAi载体连接，构建pBait-AbAi诱饵载体。经BstB I酶切后线性化，转化Y1HGold后，转化产物在SD/-Ura的缺陷培养基上生长。转化成功的酵母克隆即为诱饵酵母，这些克隆中包含稳定的pBait-AbAi，可用来筛选蛋白与基因之间的互作。从SD/-Ura培养皿上挑取诱饵酵母菌株，用100 μL 0.9%的NaCl悬浮菌体，调OD600至0.002，取100 μL悬浮菌液分别涂在对照［不含金担子素 A（aureobasidin A, AbA）］和含500 ng/mL AbA的SD/-Ura固体培养基上，30℃倒置培养3 d。将含有LAZY1启动子的pAbAi诱饵载体菌株制备成诱饵酵母感受态，再将经BamH I和Sac I双酶切构建后的pGADT7-OsMBF1质粒转化到诱饵酵母感受态中涂布于SD/-Ura/AbA平板上，30℃恒温培养3-5 d。

1.2.8 双荧光素酶检测 PCR扩增得到OsMBF1的CDS序列，通过重组方法将CDS连到‘None’载体得到none-OsMBF1效应载体。同时，将1 000 bp的LAZY1启动子克隆到190LUC载体，得到190LUCLAZY1报告载体，引物见表1。然后，通过PEG转化将none-OsMBF1效应载体和190LUC-LAZY1报告载体共转化到水稻原生质体中［15］，以空载体none和190LUC-LAZY1作为阴性对照。最后，使用Dualluciferase Reporter Assay System试剂盒和Infinite200 Pro microplate reader（Tecan）仪器检测fLUC/rLUC比值，进行3次生物学重复，每次重复测量3次。数据通过统计处理软件SPSS（version 20.0）处理，采用单因素方差进行差异显著性分析，P-value ＜ 0.05*表示差异显著，P-value ＜ 0.01 **表示差异极显著。

2 结果

2.1 LAZY1启动子的克隆及顺式元件分析

以日本晴叶片基因组DNA为模板，克隆得到LAZY1启动子的片段，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示产物大小与目标长度1 000 bp一致（图1-A）。测序所扩增LAZY1启动子片段的结果如图1-B所示，与水稻预期的LAZY1启动子序列一致，表明LAZY1启动子序列克隆成功。

为了分析LAZY1启动子所含有的顺式元件，利用PlantCARE数据库对LAZY1启动子进行顺式元件的分析，结果显示LAZY1启动子除了含有CAAT-box和TATA-box等基本启动子元件外，还含有光响应元件、植物激素响应元件和其它响应元件，其中光响应元件有ATCT-motif、Box 4、TCCC-motif、GATA-motif、G-box等元件，植物激素响应元件有脱落酸响应的ABRE元件、生长素响应的TGA-element元件以及茉莉酸甲酯响应的CGTCA、TGACG-motif等元件，其他元件包括抗旱响应的MBS及3个功能未知的作用元件（表2）。

2.2 pHIS2-LAZY1诱饵菌株的获得和自激活检测

为了得到pHIS2-LAZY1诱饵菌株，将构建的pHIS2-LAZY1诱饵载体转化酵母AH109，挑选单克隆进行PCR阳性鉴定，检测结果显示PCR片段长度为1 kb，与目标大小一致（图2-A），说明诱饵载体成功转入酵母细胞得到pHIS2-LAZY1诱饵菌株。

图2 阳性pHIS2-LAZY1诱饵菌株的鉴定及最低3-AT抑菌浓度的确定Fig.2 Identification of positive pHIS2-LAZY1 transformed bait-yeast strains and the determination of minimum inhibitory concentration of 3-AT

由于内源性酵母的转录因子可能导致组氨酸泄漏，因此需要加入3-AT来抑制这种泄露，在氨基酸营养缺陷型培养基SD-LTH中分别加入0、20和40 mmol/L的3-AT，通过观察酵母生长情况以确定最适的3-AT抑制浓度。结果表明当3-AT浓度为0和20 mmol/L时，检测组（pHIS2-LAZY1+AD）和阴性对照（pHIS2+AD53）一样都会生长。当将3-AT浓度升高至40 mmol/L时，检测组和阴性对照中酵母细胞的生长完全受到抑制，而阳性对照则正常生长。结果说明pHIS2-LAZY1在酵母AH109中不会发生自激活，因此，40 mmol/L 3-AT可作为最低抑菌浓度进行酵母单杂文库筛选。

2.3 酵母单杂文库的构建

提取日本晴萌发3 d后的幼苗RNA，电泳检测结果显示有完整的3条目的条带，其中28S和18S条带亮度明显（图3-A），表明RNA质量较好。通过SMART技术扩增合成双链cDNA，纯化电泳结果显示条带分散且分布均匀，纯化后的cDNA片段大小在400-3 000 bp之间（图3-B），说明所获得的cDNA文库中各基因的表达量均为平均水平，可用于后续反应。

将上述cDNA文库与pGADT7-rec载体共转化酵母菌株Y187，得到酵母单杂文库菌。分别将稀释后10倍（图3-C）和100倍（图3-D）的酵母细胞在YPDA平板上生长，根据菌斑生长情况使用1/100平板进行计数，cDNA文库共转的菌斑个数为370，即库容为370×1 000×30=1.11×107CFU/mL，大于1×106CFU/mL的库容要求。同时SV40大T PCR共转的菌斑个数为148，空载体转化的菌斑个数为11，由此可见cDNA文库共转的克隆数是空载体的10倍以上，即超过90%的克隆都包含同源重组后的pGADT7质粒。使用T7和AD引物进行菌落PCR，电泳检测结果显示酵母文库菌中cDNA插入片段范围为500-3 000 bp（图3-E），上述结果表明成功获得了可用于后续LAZY1上游调控因子筛选的酵母单杂文库菌。

2.4 酵母单杂文库筛选LAZY1的上游调控因子

为了得到与LAZY1启动子作用的上游调控因子，通过pHIS2-LAZY1诱饵菌与酵母单杂文库菌接合完成酵母单杂文库筛选，离心收集酵母接合菌后涂布于缺陷型SD-LTH/40 mmol/L 3-AT的平板上，培养4 d后，发现平板上有酵母接合菌落，说明酵母单杂文库菌中有猎物蛋白与pHIS2-LAZY1诱饵菌上的LAZY1启动子结合。挑取结合菌落的单克隆进行PCR检测，选取扩增条带明亮、片段长度大于500 bp的PCR产物进行测序，通过Blast比对后去除重复结果，最终得到21个LAZY1的上游调控因子，通过功能注释和文献得到这21个基因的信息，这些上游调控因子包含了1个转录因子Os08g27850、2个激素相关蛋白Os11g44810和OsGLN2、1个细胞色素蛋白OsCYP20-2、1个几丁质家族蛋白Os04g41620、8个与蛋白质合成和代谢的相关蛋白（Os02g55140、Os02g1531、Os04g20990、Os03g59310、Os12g08260、Os03g59320、Os04g53620、Os01g69950）以及8个参与糖脂类和能量代谢的相关蛋白（Os11g07020、Os01g54940、OsRBCS4、Os07g05360、Os01g05670、Os08g33820、Os01g41710、Os12g07210）（表3）。转录因子Os08g27850，属于拟南芥中AtMBF1同源基因，故命名为OsMBF1。

2.5 OsMBF1正调控LAZY1的转录

转录因子往往直接调控下游基因的表达，为了检测转录因子OsMBF1是否调控LAZY1的转录活性，采用酵母单杂和双荧光素酶检测方法检测OsMBF1对LAZY1转录活性的影响。图4显示在含500 ng/mL AbA的SD/-Ura固体培养基上酵母菌不能生长，设定抑制诱饵酵母生长的AbA浓度为500 ng/mL。通过pAbAi酵母单杂体系检测发现OsMBF1可以与LAZY1启动子产生酵母，表明两者能够在体外进行互作。

将none-OsMBF1效应载体和和190LUC-LAZY1报告载体通过PEG转化法瞬时转入水稻原生质体，以空载体none和190LUC-LAZY1作为阴性对照，以fLUC/rLUC的比值代表LAZY1启动子的相对转录活性。测量结果显示，与对照相比，当加入转录因子OsMBF1时，LAZY1启动子的相对转录活性显著增加（图4），说明OsMBF1在烟草体内能够促进LAZY1的表达，是LAZY1的正调控因子。

3 讨论

水稻LAZY1在幼苗的叶鞘维管束内侧细胞和未伸长茎维管束的外周细胞中特异表达［8］，从而快速响应答生长素信号并调控生长素的横向运输［4］。同时，LAZY1在光、暗不同处理条件下的表达也明显不同，暗处理水稻幼苗可显著提高其表达［2］。通过对LAZY1启动子序列的顺式元件分析发现它含有生长素响应元件TGA-element和多个光响应元件，由此可见，LAZY1的这种特异表达正是通过启动子上的这些生长素响应元件和多个光响应元件对生长素和不同的光暗进行响应。

本研究通过酵母单杂筛库策略共获得了21个与LAZY1启动子结合的蛋白，除了转录因子和激素响应蛋白外，还包含有8个蛋白质合成和代谢相关基因。这与近年研究表明核糖体蛋白不仅能参与蛋白质的合成，还可直接或间接调控基因转录的结论相一致［19］。而一些具有特定结构的RNA识别基序的蛋白可以与DNA结合［19］，如烟草中的剪接因子CFM3可调控烟草NIA1基因的转录［20］。在本研究中也筛选得到了一个富含丝氨酸/精氨酸的SC35-类剪接因子SCL30（Os02g15310），是一种定位于细胞核中能够识别RNA motif的蛋白质［21］。

转录因子可以直接或间接结合到下游目的基因的启动子上，从而调控目的基因的转录活性。本研究通过酵母单杂筛库得到了1个转录因子OsMBF1，双荧光素酶检测结果证明OsMBF1能够结合到LAZY1启动子上并促进LAZY1的表达，是LAZY1的正调控基因。拟南芥MBF1的C端是保守的含有50-60个氨基酸所组成的转角-螺旋-转角（helixturn-helix）结构域，能够直接结合CTAGA的顺式作用因子［22］。其中，在LAZY1启动子的1 000 bp序列中含有2个CTAGA顺式作用元件，推测其也有可能通过结合LAZY1启动子的CTAGA元件从而调控表达。此外，MBF1也是一种转录共激活因子，能够连接转录因子和TATA-box结合蛋白直接调控下游目的基因的表达，在进化上高度保守［23］。MBF1可以通过对生长素等激素的响应，参与调控植物的生长发育，包括花器官和种子的发育，从而提高产量［24］。而LAZY1作为生长素快速应答和横向运输调控途径的关键基因，OsMBF1可能参与了LAZY1介导的生长素响应和运输途径。前期报道发现热激蛋白OsHSFA2D是水稻LAZY1的上游调控基因，当OsHSFA2D发生突变后将导致LAZY1的表达下降，植株分蘖角增大［13］，但目前未发现OsHSFA2D可以直接结合LAZY1的启动子。在拟南芥、小麦（Triticum aestivum）、大豆（Glycine max）、苔藓（Polytrichastrum alpinum）甚至低等植物红藻中发现，MBF1能够增强植物对非生物应激胁迫的反应，特别是在热应激反应中的反应，热胁迫处理将会导致MBF1的表达量增加［25-26］。在水稻中异源过表达小麦TaMBF1能够促进植株对热胁迫的能力［27］，推测MBF1与热激蛋白可能存在潜在联系，但是还需要进一步实验证明。