液相色谱仪自动进样器样品室温度的校准

黄彬磊，曾宪钰，李贝琦

（上海市质量监督检验技术研究院，上海 201114）

液相色谱仪由输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统等部分组成，根据固定相和流动相间吸附和分配系数的差异，将样品各组分分离，先后进入到检测器中，由数据处理系统记录得到色谱图，根据保留时间与响应值进行定性、定量分析。从1903 年俄国植物学家Tswett 发明柱吸附色谱技术，到20世纪70年代初高效液相色谱仪出现，再到2004 年美国沃特世公司首次推出商品化的超高效液相色谱仪[1]，直至今天，液相色谱仪以其高分辨率、高灵敏度、高分离效率等优点，被广泛应于生物医药[2-3]、食品检测[4-5]、环境分析[6-7]、石油化工[8]、纺织品检测[9]等各种领域。

液相色谱仪的进样系统可以分为自动进样器与手动进样器大类，相比于手动进样器，使用自动进样器可以大大节约液相色谱检测的时间成本，当前大多数的液相色谱仪都配备了自动进样器。随着液相色谱仪自动进样器的不断发展，目前不少自动进样器具备了样品室温度控制的功能。因为在液相色谱检测中，一些对温度敏感的样品对要求样品室温度应控制在一定范围内。比如中国药典中阿奇霉素[10]、头孢呋辛钠[11]的相关检测中都对样品室的温度有要求。特别在液相色谱仪自动进样器飞速发展的今天，自动进样器样品室容纳的样品数量越来越多，在样品室中放置一批样品后仪器便连续长时间工作，这样的情况经常出现，而对于温度敏感的样品在样品室中长时间储存时，必须对样品室的温度进行控制，以免样品变质。因此液相色谱仪自动进样器的温度控制功能十分重要，而温度控制是否准确、均匀、稳定，则需要通过计量校准来确认。

目前现有的液相色谱仪国家检定规程JJG 705—2014 《液相色谱仪检定规程》[12]和液相色谱仪的国家标准GB/T 26792—2019 《高效液相色谱仪》[13]中均没有涉及进样器。液相色谱仪自动进样器的国家标准 GB/T 38125—2019 《液相色谱仪用自动进样器》[14]中则没有涉及样品室温度。有学者对液相色谱仪自动进样器的校准与测试进行了研究[15-18]，但都不涉及样品室温度。笔者针对液相色谱仪自动进样器样品室温度提出相关的校准项目、校准方法、技术指标与校准设备，以保证其温度控制的准确性和溯源性。自动进样器样品室温度校准所使用的设备，除了传统的有线温度传感器，还有近些年生物化学计量领域应用较多的小型无线温度传感器，笔者从结构适应性和实际测量结果对两者进行了对比分析。

1 液相色谱仪自动进样器样品室的温控原理和布局结构

目前液相色谱仪自动进样器样品室多采用帕尔贴元件进行温度控制，风扇从样品室区域抽取空气，使空气通过冷却/加热模块，并按照设置的目标温度进行冷却或加热。在冷却模式中，帕尔贴元件冷却的一侧会发生冷凝，该冷凝水会通过管道导出至自动进样器样品室之外。通过冷却/加热模块形成的恒温空气再流动至样品盘区域并均匀分布于样品盘各处，实现对样品盘上样品瓶的有效控温。对其温度进行计量校准，温度传感器的布点位置也需要选择在样品瓶所在的位置。

液相色谱仪自动进样器样品室的布局结构对于其温度校准方法及校准设备的选择有不小的影响，而目前液相色谱仪厂家型号众多，样品室布局结构也有不小的差异。笔者对主流液相色谱仪自动进样器样品室的布局结构进行了分类，分类方法主要基于自动进样器样品盘的切换方式。当前液相色谱仪自动进样器的结构朝着大量样品瓶与多样品盘的方向发展，一个自动进样器往往有不止一个样品盘，而样品盘之间的切换方式对于自动进样器样品室温度的计量操作有较大的影响。笔者将其分为三类，分别为抽屉式、旋转式和固定式。抽屉式指样品盘放置在类似抽屉的结构中，可拉出或推进，放置好的样品盘再通过自动进样器的机械操作移动到指定位置进样，如Agilent 1260/1290 Infinity Ⅱ Multisampler进样器、SHIMADZU SIL-30AC 自动换架器进样器。旋转式是指多个样品盘之间以旋转的方式进行切换，每一次旋转只有部分样品盘会出现在操作者可操作的区域，其它样品盘则处于非操作区域，不可取放样品，如Thermo Fisher Ultimate 3000 进样器，Waters Alliance e2695 进样器。固定式如Agilent 1200 系列进样器、Agilent 1260/1290 Infinity Ⅱ进样器、Waters ACQUITY 系列进样器。如果所有样品盘可同时出现在操作者可操作的区域，即使以旋转方式切换样品盘，仍将其归为固定式，因为其不影响样品室温度校准中传感器的布点操作，如Thermo Fisher Vanquish进样器。

2 液相色谱仪自动进样器样品室温度的校准项目和校准方法

液相色谱仪自动进样器的样品盘是多孔位的，其温度控制是要实现对所有孔位的有效控温，这类多孔位的温度控制类似于聚合酶链反应分析仪（PCR）的96 孔板和化学需氧量（COD）测定仪消解炉消解孔的控温。虽然样品孔位数量、样品体积和温度范围与上述两者都有区别，但是液相色谱仪自动进样器样品室温度的校准项目的设立可以参考这两者的国家计量技术规范，即JJF 1527—2015 《聚合酶链反应分析仪校准规范》[19]与JJG 975—2002 《化学需氧量（COD）测定仪检定规程》[20]。以上两个国家计量技术规范中均设立了温度示值误差和温度均匀性两个校准项目，用以考察其温度是否准确、均匀。而准确性与均匀性对于液相色谱仪自动进样器样品室的温度而言也是至关重要的，其温度必须准确才能保证样品室中的样品处于所需的温度环境中，其温度也必须均匀才能保证样品瓶放置在不同的孔位都能够得有效的控温。温度示值误差的温度测量点选取5、20、35 ℃，因为目前市场上的液相色谱仪自动进样器标明的样品室温度控制范围绝大多数为（4～40） ℃，选取的以上三个温度测量点位于该温控范围的高、中、低三个位置，用以考察自动进样器样品室在高、中、低三个温度区间的控温效果。另外多数液相色谱仪的使用者对于其自动进样器样品室的控温需求是保持低温，因此特别选取5 ℃这个靠近温控范围下限的温度测量点。

除了准确性与均匀性以外，样品室温度的稳定性也很重要，因为在液相色谱仪的使用中，样品瓶在样品室中保存十几小时的情况是经常出现的。考虑到计量的时间成本，温度稳定性的测量时间不宜过长，参考JJG 705—2014 《液相色谱仪检定规程》[12]中柱箱温度稳定性的测量时间为1 h，故将自动进样器样品室温度稳定性的测量时间设置为1 h。

液相色谱仪自动进样器样品室温度的具体校准项目和校准方法如下。

2.1 温度示值误差

根据样品室与样品盘的结构，均匀选取不少于6个样品孔位，将温度传感器置于所选样品孔位中，样品室温度分别设置为5、20、35 ℃，待温度稳定后读取各个温度传感器测量值Ti，求其算术平均值Tm，按式（1）计算各个温度测量点的示值误差：

式中：T0——样品室温度设定值，℃；

Tm——样品室各温度点测量平均值，℃；

ΔT——温度示值误差，℃。

2.2 温度均匀性

取2.1所得温度传感器测量值Ti中的最大值Tmax与最小值Tmin，按式（2）计算各个温度测量点的温度均匀性：

式中：Tmax——各孔位温度测量值中的最大值，℃；

Tmin——各孔位温度测量值中的最小值，℃；

ΔTu——温度均匀性，℃。

2.3 温度稳定性

按照2.1布点位置和测量方式，样品室温度设置为20 ℃，待温度稳定后读取第一次温度测量值Tt,1，然后每隔10 min读取一次温度测量值Tt,i，直至第60 min读取第7次温度测量值Tt,7。每次温度测量值均为各孔位温度的算术平均值，按式（3）计算得到温度稳定性：

式中：Tt,max——7次温度测量值中的最大值，℃；

Tt,min——7次温度测量值中的最小值，℃；

ΔTs——温度稳定性，℃。

3 技术指标

液相色谱仪自动进样器样品室的温度主要影响样品的储存，而样品的储存温度一般不会过于苛刻，因此其技术指标相较于液相色谱仪柱箱温度可适当放宽。JJG 705—2014 《液相色谱仪检定规程》[12]中柱箱温度最大允许误差为±2 ℃，柱箱温度稳定性为≤1 ℃/h，因此将自动进样器样品室温度示值误差和温度稳定性的技术指标分别设定为±3 ℃和≤2 ℃/h，温度均匀性的指标设定为≤3 ℃见表1。

表1 液相色谱仪自动进样器样品室温度的计量特性技术指标

4 校准设备

4.1 校准设备的技术要求

温度测量设备：测量范围为（4～40） ℃，分辨率不大于0.1 ℃，最大允许误差±0.3 ℃，能够同时测量不少于6个孔位的温度。需根据液相色谱仪自动进样器样品室的结构选择有线温度测量方式与无线温度测量方式。

4.2 有线温度测量方式

有线温度测量方式是采用有线的温度传感器，如热电偶等，将其插入需要测量的孔位进行温度测量。这种测量方式的优势为有线温度传感器价格较低，一般计量机构均有配备，不需要另行购置。并且JJG 705—2014 《液相色谱仪检定规程》[12]中要求测量柱箱温度，按照规程要求，需要配备数字温度计，若该测温设备具备连接多个有线温度传感器的功能，即可直接用于测量自动进样器样品室温度。

但是有线温度测量方式有明显的局限性。如前文所述，自动进样器样品室的布局结构对校准设备的选择有较大的影响，如果样品盘为抽屉式，连接多根有线温度传感器可能会导致其抽屉无法正常闭合，也就无法正常测量样品室温度。如果样品盘为旋转式，则其旋转会导致有线温度传感器缠绕或牵扯，难以固定，甚至可能导致样品盘切换卡顿造成损坏。因此有线温度测量方式一般只适用于样品盘为固定式的自动进样器，即使是这类自动进样器，有线温度传感器的连接线也有可能导致样品室门不能完全闭合，测量温度时还需要通过胶带等方式辅助固定，否则容易导致温度探头脱离样品孔。而如果采用无线温度测量方式则能够很好的避免上述这些问题。

4.3 无线温度测量方式

随着近几年生物化学仪器计量校准能力的提升，为了测量体积较小的96 孔板孔位中的温度，小型无线温度传感器在生物化学计量领域也获得了较大的发展，得到了广泛的应用。例如JJF 1527—2015 《聚合酶链反应分析仪校准规范》[19]和JJF 1874—2020 《（自动）核酸提取仪校准规范》[21]中都需要使用这类小型无线温度传感器，其中有的是将多个传感器集成为一块完整的96孔板样式，而有的小型温度传感器则可以各自独立放置。这类可独立放置的小型无线温度传感器正好适合于测量液相色谱仪自动进样器样品室的温度，因为其可以自由移动放置在需要测量的目标孔位上，并且液相色谱仪的样品孔体积远大于96孔板的样品孔体积，因此该温度探头可以很容易的置于其中，液相色谱仪样品孔上方的空间也足够容纳这类小型无线温度传感器。测量时将其放置在需要测量的目标孔位，通过无线信号传输，将测量结果传输至电脑或其它相应的数据记录仪上。

使用无线温度测量方式能够完全避免有线温度测量方式中有线温度传感器缠绕、牵扯、难以固定、致使样品室闭合不严等诸多问题，因为这类无线温度传感器就像液相色谱仪的样品瓶一样放置于样品孔上，样品盘的移动和转动都影响测定，从而对抽屉式、旋转式、固定式各类自动进样器都能实现稳定良好的测量。并且，在实际操作中，由于没有线的束缚，这类小型无线温度传感器能够轻易的放置于样品瓶所处的样品孔中心位置，而有线温度传感器使用胶带固定后虽然也能保证其探头一端处于样品孔内，但由于空间狭小，很难保证其不出现贴壁或触底的情况，对温度测量造成一定的影响。

从测量准确度上来说，无线温度传感器与有线温度传感器基本一致。JJF 1874—2020 《（自动）核酸提取仪校准规范》[21]中对测温设备也就是无线温度传感器最大允许误差的要求为±0.3 ℃，而JJG 705—2014 《液相色谱仪检定规程》[12]中对有线数字温度计的要求也是±0.3 ℃，均能满足液相色谱仪自动进样器样品室温度测量的需求。

笔者分别采用有线温度测量方式与无线温度测量方式对同一台液相色谱仪自动进样器样品室的温度进行校准，对比其结果。

5 无线温度测量方式与有线温度测量方式校准结果的对比

5.1 目标设备

Agilent 1260 Infinity Ⅱ液相色谱仪自动进样器。

5.2 校准设备

有线温度测量仪：Vtest-1101X 型，温度测量范围为0～300 ℃，U=0.1 ℃（k=2），福建省计量科学研究院/微测仪器（福州）有限公司。

无线温度测量仪：CYTC-NAE-SS型，温度测量范围为0～120 ℃，U=0.1 ℃（k=2），产越（上海）电子科技有限公司。

5.3 校准结果

有线温度测量方式与无线温度测量方式的校准结果见表2。结果表明目标自动进样器样品室的温度十分稳定，为两种测量方式的对比奠定基础。两种测量方式所得到的温度测量值十分接近，两种方法对于自动进样器样品室温度的测量都是准确可靠的。在温度均匀性方面，仅在20 ℃时两者比较一致，5 ℃和35 ℃时无线温度测量方式所得到的温度均匀性结果优于有线温度测量方式，特别是在35 ℃时无线温度测量方式得到的均匀性结果为0.6 ℃，而有线温度测量方式为1.3 ℃，两者有0.7 ℃的差距。在5 ℃时两者也有0.3 ℃的差距。产生这种差距的原因主要是有线温度传感器的连接线导致样品室门不能完全闭合，致使样品室内温度受到样品室外温度一定的干扰。当样品室温度设置为20 ℃时，其与样品室外温度（20 ℃）接近，因此干扰较小，所测得的均匀性结果也与无线温度测量方式基本一致。而当样品室温度为5、35 ℃时，样品室外温度与样品室内温度差距较大，产生的干扰也较大，所以导致这两个温度点所得到的均匀性结果与无线温度测量方式有一定的差距。其次，样品孔内孔间狭小，受到连接线的阻碍，有线温度探头在孔内的位置不像无线温度探头那么容易控制，可能出现贴壁或触底的情况，不利于温度均匀性的测量，所以温度均匀性测量结果稍高，所以从实际测量操作及其测量结果的角度出发，无线温度测量方式优于有线温度测量方式。

表2 有线温度测量方式与无线温度测量方式的校准结果

6 结语

液相色谱仪自动进样器样品室的控温效果的优劣直接影响着液相色谱样品的储存和测试，为保证液相色谱仪自动进样器样品室温度的准确性与溯源性，结合温控原理和布局结构提出相关的校准项目、校准方法与技术指标。关于其校准设备，笔者提出了有线温度测量方式与无线温度测量方式两种方法，并进行对比。两者测量准确度相当，但无线温度测量方式能够适用于各种布局结构的自动进样器样品室，且测量结果的均匀性也较好。而有线温度测量方式虽然具备易于获得且成本较低的优势，但由于其连接线的存在可能会导致抽屉式样品室的抽屉与固定式样品室的门无法正常闭合，对于旋转式的样品室则可能出现连接线缠绕、牵扯的状况，致使温度测量无法正常进行，并且由于连接线的约束，其温度探头一端的位置也不易控制，影响温度均匀性的测量结果，因此无线温度测量方式更适合用于液相色谱仪自动进样器样品室温度的计量校准。