乳液中氢醌的基体标准物质制备

2023-10-25刘彤彤金绍明曹进宁霄

化学分析计量 2023年9期

刘彤彤，金绍明，曹进，宁霄

［中国食品药品检定研究院，国家市场监管重点实验室（食品质量与安全），北京 100050］

氢醌（对苯二酚）长期以来被用于美白祛斑类化妆品中，通过抑制酪氨酸酶活性来阻止黑色素生成，是一种有效的美白成分。研究和临床数据证实，氢醌对哺乳动物细胞具有潜在的诱变性[1]，长期过量使用会对皮肤产生刺激性、致敏性甚至致癌[2-3]。

目前氢醌在国内外被归为化妆品禁限用成分，欧盟化妆品法规（EC）No 1223/2009中，氢醌为禁用组分，仅可在染发剂和人造甲中使用，且用量(质量分数)不超过0.3%和0.02%[4]；美国化妆品原料评价委员会（CIR）2015 年对氢醌规定：用于染发剂和人造甲的氢醌使用量(质量分数)不超过1%，不得使用于驻留类化妆品中[5]；我国《化妆品安全技术规范》（2015版）规定：化妆品中禁止使用氢醌[6]。

美白祛斑类化妆品市场规模大且存在产品质量参差不齐、虚假宣传等问题[7-8]，因而对禁用成分氢醌的监测十分必要。由于化妆品基质复杂多样[9]，为避免基质效应影响检测准确度[10]，满足检测过程中质量控制需求，有必要研制相关基体标准物质，但目前市场上未见乳液中氢醌标准物质出售，为填补市场空白，笔者研制出乳液基体中氢醌标准物质，可为化妆品中特别是乳液类美白产品中氢醌的检测提供质量控制，对化妆品基体标准样品的研制流程和方法有一定借鉴作用。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：UltimateTM3000型，美国赛默飞世尔科技有限公司。

电子分析天平：（1）XP 205 型，感量为 0.01 mg；（2）AL 204 型，感量为 0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多有限公司。

超纯水系统：Milli-Q 型，密理博（中国）有限公司。

氢醌标准品：纯度（质量分数）为99.7%，上海安谱实验科技股份有限公司。甲醇：色谱纯，美国赛默飞世尔科技有限公司。乳液原料：化妆品乳液（不含氢醌的阴性乳液样品）。

实验用水为超纯水。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备

选用市售化妆品乳液作为加工原料（原料为不含氢醌的阴性乳液样品）满足标准物质制备的适用性、代表性原则，及均匀性、稳定性的要求[11]。添加一定量的氢醌标准品，充分混合均匀后，再进行分装（5 g/瓶），于棕色塑料瓶密闭储存，共计500瓶。

1.2.2 样品预处理

称取样品1 g（精确至 0.001 g）于具塞比色管中，用甲醇定容至10 mL，常温超声提取15 min，取上清液，经0.45 μm滤膜过滤，滤液作为样品溶液。

1.2.3 氢醌标准溶液配制

氢醌标准储备溶液：1 000 mg/L，称取氢醌标准品0.1 g（精确至0.000 1 g）于烧杯中，用少量甲醇溶解后，转移至 100 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至标线。于4 ℃暗处保存，在一个月内稳定。

氢醌系列标准工作溶液：取适量氢醌标准储备溶液，用甲醇稀释成质量浓度分别为1.0、5.0、10.0、50、100 mg/L。

1.2.4 色谱条件

色谱柱：C18柱（150 mm× 3.9 mm，5 μm，赛默飞世尔科技公司）；流动相：甲醇-水（体积比为60∶40），流量为1.0 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：室温；进样体积：5 μL。

1.2.5 样品测定

在1.2.4色谱条件下，取氢醌系列标准工作溶液分别进样，以标准工作溶液质量浓度为横坐标，对应的色谱峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线。取样品溶液进样，记录色谱图，测得色谱峰面积，利用标准曲线法得到样品溶液中氢醌的质量。

1.3 样品均匀性和稳定性考察

分别参照 CNAS-GL003：2018 《能力验证样品均匀性和稳定性评价指南》[12]、CNAS-GL017：2018《标准物质/标准样品定值的一般原则和统计方法》[13]、JJF 1343—2022《标准物质的定值及均匀性、稳定性评估》[14]中关于均匀性、稳定性检验的要求进行统计分析。

1.3.1 均匀性检验

参照JJF 1343—2022中均匀性检验对抽取单元数量和重复测定次数的要求，随机抽取15 个样品，每个样品重复测定2 次，进行均匀性检验。采用单因素方差分析(ANOVA)的F检验进行统计分析。

1.3.2 短期稳定性检验

模拟在40 ℃，湿度80%的运输条件下，以均匀性检验测定结果为初始值（0 天测定值），分别在1、3、7 天取样，每次取3个样品，每个样品测定2次，采用t检验法评价样品的短期稳定性。

1.3.3 长期稳定性检验

在2～8 ℃、避光干燥的保存条件下，按照先密后疏[14]原则，以均匀性检验测定结果为初始值（0 月测定值），分别在1、2、4、6月取样，每次取3个样品，每个样品测定2次，采用t检验法评价样品的长期稳定性。

1.4 定值方法及不确定度评定

标准物质定值参照JJF 1343—2022 和ISO Guide35∶2006[15]，采用一种方法多家实验室联合定值的方式，选择2家具备检验资质的机构，连同本实验室，共计3 家，使用相同方法，对乳液中氢醌含量进行测定。向另外两家实验室分别发放5 个样品，每个样品重复测定2 次，对回收数据使用格拉布斯（Grubbs）检验剔除组内离群值，使用狄克逊（Dixon）法检测各组数据的中位值是否有显著性差异。最终使用各实验室检测结果中位值的中位值作为样品定值结果。

参照GB/T 15000.3—2008[16]，对均匀性、稳定性和指定值带来的不确定度进行定量，并将各来源不确定度进行合成及扩展，得到乳液中氢醌含量的扩展不确定度。

2 结果与讨论

2.1 均匀性检验结果

按照1.3.1方法，从500个样品中随机抽取15个进行均匀性检验，乳液中氢醌质量分数测定结果列于表 1，采用单因素方差分析测定结果，统计结果如表2所示。在α=0.05时，查表得F0.05(14,15)=2.42，由表2可知，乳液中氢醌标准物质的F计算值为1.57，F＜F0.05(14,15)，表明组内和组间无明显差异，乳液中氢醌标准物质的均匀性良好。

2.2 稳定性检验结果

2.2.1 短期稳定性

标准物质短期稳定性的考察主要是模拟在运输过程中高温、高湿条件对乳液中氢醌含量的影响[17]，因此将分装好的样品置于温度40 ℃、湿度80%的恒温恒湿箱中，考察其在7天内的稳定性，按照1.3.2方法考察短期稳定性，乳液基体中氢醌质量分数测定结果见表3。

由表3 可知，均匀性检测结果平均值作为长期稳定性0 天的测定值，与1、3、7 天的测定结果以时间-测定值做线性拟合，置信水平为95%时，斜率P=0.348 9＞0.05，表明在温度40 ℃、湿度80%条件下，乳液中氢醌标准物质在7天内稳定。

2.2.2 长期稳定性

标准物质的长期稳定性主要考察指定储存条件下，标准物质保持特性值在一定限度内的特性[18]。按照1.3.3 方法，考察乳液中氢醌标准物质在2～8 ℃、避光干燥的保存条件下，6个月内的稳定性，结果见表4。

由表4 可知，均匀性检测结果平均值作为长期稳定性0月的测定值，与1、2、4、6月的测定结果以时间-测定值做线性拟合，置信水平为95%时，斜率的P=0.150 2＞0.05，说明在推荐储存条件下，乳液中氢醌标准物质长期稳定性良好。

2.3 协作定值结果及离群值检验

本标准物质采用多家协同定值的方式，由两家业内具备资质的检验机构（机构A和B）和样品制备方（机构C）协作定值，分别向其它两家机构提供5个样品，每个样品重复测定2 次。机构A 和B 对乳液中氢醌的质量分数测定结果见表5，制备方以均匀性检验结果参与定值（测定结果见表1）。

表1 均匀性检验氢醌质量分数测定结果 μg/g

表2 均匀性检验统计结果

表3 短期稳定性检验氢醌质量分数测定结果 μg/g

表4 长期稳定性检验氢醌质量分数测定结果 μg/g

对3 家实验室的测定数据进行筛选，利用格拉布斯（Grubbs）检验剔除组内可疑值，未发现异常值；采用狄克逊（Dixon）法检测各组数据的中位值是否有显著性差异，结果全部通过狄克逊检验，表明各组组间中位值无显著性差异。通过上述分析计算，可保留所有数据，样品定值结果为各实验室检测结果中位值的中位值见表6。