高效液相色谱-串联质谱法测定血液和尿液中12种杀鼠剂

2023-10-25游慧圆刘云富谭广辉吴燕梅

化学分析计量 2023年9期

游慧圆，刘云富，谭广辉，吴燕梅

（1. 惠州市职业病防治院，广东惠州 516008； 2. 惠州市农产品质量安全监督检测中心，广东惠州 516008）

杀鼠剂种类繁多，使用广泛。其中抗凝血杀鼠剂自1944 年面世以来，由于其适口性好，不易产生抗食性，具有广谱、高效、可口、毒性相对较低、不易引起二次中毒且有特效解毒药维生素K1等特点，被广泛应用于室内外杀鼠,是我国目前使用最广泛的的杀鼠剂，既有利于彻底消灭投饵区的鼠群，而又能减少非靶标动物误食中毒机会。但由于使用范围广或管理疏漏，人和动物中毒及投毒事件时见报道[1-9]。

安妥又名1-萘基硫脲、α-萘硫脲，是一种硫脲类急性杀鼠剂，选择性强，主要用于防治褐家鼠及黄毛鼠。安妥能引起急性中毒且能致癌，所以国家已经明令禁止在鼠药中使用安妥，但因其对鼠类杀灭效果好，市场上仍有销售，安妥致人、畜中毒事件时有发生[10-12]。鼠立死是一种高效、剧毒、急性杀鼠剂，其毒作用为维生素B6 拮抗剂，干扰r-氨基丁酸的氨基转移和脱羧反应，中毒症状为典型的神经性毒剂症状具有灭鼠谱广、使用浓度低的特点。鼠立死的突出优点是蓄积毒性微弱，不易发生二次中毒，有高效解毒剂、毒饵浓度低，是一种理想的急性杀鼠剂，被用于田野灭鼠。毒鼠碱是由马钱子中提取的一种生物碱，可用作鼠药以控制啮齿类动物，但其对大多数家畜有很高的毒性作用，曾有文献报道毒鼠碱所致人员中毒情况[13]。

由于抗凝血杀鼠剂种类繁多，化学结构相似，容易混淆，而且不易挥发，所以目前对抗凝血杀鼠剂的检测研究主要集中于液相色谱法[14-18]和液相色谱-质谱联用法[19-26]。见诸报道的安妥测定法有液相色谱法[27]和高效液相色谱-质谱联用法[25,28]，鼠立死用高效液相色谱-质谱联用法[20,30]或气相色谱-质谱联用法[29]测定，而毒鼠碱的测定方法未见报道。由于鼠药种类繁多，临床救治迫切需要实验室能够在短时间内确定毒物种类，所以目前鼠药测定方法的研究主要集中于多组分同时测定。

笔者利用液相萃取结合高效液相色谱-串联质谱 (HPLC-MS/MS) 法，建立了血液和尿液样品中溴鼠灵、杀鼠醚、溴敌隆、杀鼠灵、氯杀鼠灵、克灭鼠、异杀鼠酮、氯敌鼠、敌鼠、鼠立死、安妥、毒鼠碱12种灭鼠剂的检测方法。该方法简便、快速，准确度高，精密度好，适用于疑似鼠药中毒病人的全血和尿液样品中鼠药的定性、定量测定，为化学中毒原因分析和临床救治提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪：6460型，美国安捷伦科技有限公司。

MS3型漩涡混合器：MS3型，德国IKA公司。

全自动平行浓缩仪：Auto EVA 80，睿科集团（厦门）股份有限公司。

超声波清洗器：KQ7200DV 型，江苏金怡仪器科技有限公司。

漩涡振荡器：SL-0246 型，美国Scientific Industries（思博明）公司。

高速台式离心机：Allegra 64R 型，美国贝克曼库尔特公司。

纯水系统：Direct-Q型，美国密理博有限公司。

乙腈：色谱纯，德国默克公司。

甲酸、乙酸铵：优级纯，天津科密欧有限公司。

10 种杀鼠剂标准溶液：质量浓度均为100 µg/mL，溴鼠灵，溶剂为甲醇，编号为1ST23008-100M；杀鼠醚，溶剂为甲醇，编号为1ST23009-100M；杀鼠灵，溶剂为甲醇，编号为1ST23011-100 A；氯杀鼠灵，溶剂为甲醇，编号为1ST23001-100M；克灭鼠，溶剂为乙腈，编号为1ST23012-100 A；异杀鼠酮，溶剂为甲醇，编号为1ST23003-100M；氯敌鼠，溶剂为甲醇，编号为1ST000467-100M；鼠立死，溶剂为甲醇，编号为1ST23006-100M；安妥，溶剂为乙腈，编号为1ST000665-100 A；毒鼠碱，溶剂为乙腈，编号为1ST23016-100 A；天津阿尔塔公司。

溴敌隆标准溶液：质量浓度为100 µg/mL，溶剂为乙酸乙酯，编号为SB05-141-2008，农业保护科研监测所。

敌鼠标准溶液：100 µg/mL，溶剂为甲醇，编号为1033，北京中卫永晟科技有限公司。

质量控制样品：各组分质量浓度均为0.1 µg/L，（1）含有牛血中溴鼠灵和溴敌隆，编号为GDOHNY BZ005；（2）尿中杀鼠醚和杀鼠灵，编号为GDOHN YBZ017，广东省职业病防治院。

实验用水：经超纯水机制取的超纯水。

1.2 标准溶液配制

分别移取12 种杀鼠剂各0.5 mL 于10 mL 容量瓶中，加入乙腈定容至标线，配制成各组分质量浓度均为5.0 µg/mL 的混合标准储备液；另取10 只2 mL容量瓶，每5 只1 组，分成2 组，每组分别加入0、20、40、200、400 µL 混合标准应用液，分别以全血/尿液空白基质配制校准工作溶液，配制成各组分质量浓度均分别为0.0、0.05、0.10、0.50、1.00 µg/mL的血液、尿液基质系列混合标准工作溶液。

1.3 样品预处理

取1 mL 血样(或尿样)于10 mL 离心管中，以5 000 r/min转速离心3 min，取上层清液至另一离心管中，涡旋振荡的同时加入3 mL 乙腈，再以15 000 r/min转速离心3 min，上清液全部转移至另一10 mL塑料萃取管中，置于40 ℃氮吹仪上浓缩吹干至0.5 mL，取上清液进样。

1.4 仪器工作条件

1.4.1 色谱仪

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱(3.0 mm × 150 mm，1.8 µm，美国安捷伦科技有限公司)；进样体积：6 µL；流动相：A 相为5 mmol/L 乙酸铵-0.02 %甲酸-水，B 相为乙腈，A 与B 的体积比为1∶1，流量为0.50 mL/min，梯度洗脱见表1；柱温：40 ℃。

1.4.2 质谱仪

多反应监测模式；含喷射流离子聚焦技术的电子喷雾离子源；雾化器压力：276 KPa；干燥气：空气，温度为280 ℃，流量为9.0 L/min；鞘气：空气，温度为350 ℃，流量为11 L/min；毛细管电压：正、负离子模式分别为4 000、3 500 V；喷嘴电压：正、负离子模式均为500 V；扫描方式：鼠立死、安妥、毒鼠碱三种杀鼠剂为正离子扫描，其余9 种为负离子扫描。12 种鼠药的色谱保留时间及质谱分析参数见表2。

表2 12种鼠药的色谱保留时间及质谱分析参数

1.5 定量方法

以全血和尿液空白基质配制校准溶液，经高效液相色谱-质谱联用仪检测，以色谱峰面积外标法定量。

2 结果与讨论

2.1 样品预处理方法的优化

试验比较了HLB 固相萃取法和液液萃取法两种样品处理方法。结果表明，HLB固相萃取法用时过长，回收率太低，不利于对中毒样品的应急处理。由于中毒样品的检测有时效性以及灵敏度的要求，在样品处理的过程尽量减少转移的次数。

采用改进后3 次转移的方法，同时对丙酮、乙腈、乙酸乙酯作为提取溶液进行比较。对于全血样品，采用乙腈蛋白沉淀法可获满意结果，鼠药回收率均可达到70%以上。而使用乙酸乙酯鼠药的回收率只有40%左右，丙酮回收率更低，只有20%左右。

采用一边滴加乙腈一边涡旋振荡的方法可以提高乙腈提取率，避免蛋白沉淀物包裹待测物。另外对比尼龙滤膜对待测组分的吸附作用，发现尼龙滤膜对12种杀鼠剂有不同程度的吸附作用，尼龙滤膜对杀鼠醚、鼠立死的吸附严重，因此样品不进行滤膜过滤，而是采用取上清液直接进样。

2.2 质谱条件的优化

移取杀鼠剂混合标准溶液，分别在电喷雾正、负离子检测方式下对质谱测定条件进行优化，选择质谱响应最强的模式为最佳条件。经过测定后发现，鼠立死、安妥、毒鼠碱仅在正离子模式下离子化，其它化合物在正负两种模式下均可离子化，但在负离子模式下响应更高，因此选择在ESI正离子MRM模式下监测鼠立死、安妥、毒鼠碱，在ESI负离子MRM模式下监测另外9种杀鼠剂。

进一步对12 种杀鼠剂的去簇电压、碰撞能量、驻留时间等质谱参数进行优化，最终得到12种杀鼠剂的质谱条件见1.4。

2.3 色谱条件的优化

试验比较了甲醇、乙腈的两种有机流动相对待测组分的分离效果以及离子化效率，结果发现乙腈作为流动相时，虽然响应值稍低，但其色谱峰形较好。

分别比较了20、10、5、2 mmol/L 的乙酸铵-0.02%甲酸-水4 种不同浓度流动相体系对色谱峰形及响应值的影响。试验结果表明，当选择在Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(3.0 mm×150 mm，1.8 µm，美国安捷伦科技有限公司)为分析柱下，采用5 mmol/L 乙酸铵-0.02%甲酸-水作为流动相时，各目标组分的色谱峰形均比较理想，分析灵敏度较高。