气相色谱法测定交联透明质酸钠凝胶的修饰度

王宝群，甄政安，林莎莎，陈醒，邹圣灿，李亚利

（青岛琛蓝海洋生物工程有限公司，山东青岛 266100）

透明质酸（HA）是由D-葡糖醛酸和N-乙醛基-D-氨基葡糖双糖单位重复连接组成的一种链性聚阴离子黏多糖[1-3]，是构成皮肤、玻璃体、关节滑液和软组织的成分，具有独特的理化性质和生物学功能[4]。天然的透明质酸易被体内的透明质酸酶迅速降解，在体内保持时间短，限制了其在临床上的应用[5-8]。为了解决这个问题，通常使用交联剂对其进行化学修饰，稳固透明质酸在体内的维持时间[9-13]。目前常使用的交联剂有二乙烯基砜（DVS）[14]和1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE）[15]。

修饰度是指交联剂修饰透明质酸凝胶的程度，是凝胶的重要性能指标之一。修饰度又分为悬挂修饰度和交联修饰度（悬挂修饰指BDDE 分子只有一端与HA 分子连接，另一端游离；交联修饰指BDDE分子两端同时与HA 分子连接，也叫有效交联）[16]。修饰度与凝胶的降解能力、吸涨程度紧密相关[17-19]。利用测量修饰度可以反应凝胶的物理化学性能，并直接影响凝胶体内降解性能，从而影响产品的生物安全性；当交联度偏小时，会影响凝胶的稳定性和抗降解性；当交联度偏大时，会引起人体的排斥反应，从而增加凝胶植入的风险[14]。杨彪[20]等使用酶解法将凝胶降解为双糖，采用分子排阻色谱法对产物分离，然后使用H-NMR和质谱仪分析，利用面积归一法计算凝胶的修饰度，但该方法操作繁琐，检测周期长。

笔者以丙三醇为外标，利用气相色谱法检测交联透明质酸钠凝胶经酸解后得到的样品中丙三醇浓度，再计算出凝胶的修饰度，该方法不仅简便、快速，而且具有较高的精密度和准确性。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

精密电子天平：PX224ZH/E 型，感量为0.1 mg，奥豪斯仪器（常州）有限公司。

气相色谱仪：岛津-GC2014C型，配有氢火焰离子化（FID）检测器，日本岛津公司。

恒温搅拌器：HJ-6B 型，金坛市城东新瑞仪器厂。

超声波清洗器：KQ-600DE型，昆山市超声仪器有限公司。

pH计：PHS-3E型，上海仪电科学仪器股份有限公司。

离心机：GL-20G-II型，上海安亭科学仪器厂。

丙三醇标准品：质量分数不低于99.7%，上海麦克林试剂有限公司。

无水乙醇：高效液相色谱级，天津科密欧化学试剂有限公司。

氢氧化钠：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

氢溴酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

高纯氮气：质量分数为99.999%。

交联透明质酸钠凝胶样品：20220606 批，自制样品。

实验用水为超纯水。

1.2 色谱条件

色谱柱：PEG-20M毛细管柱（30.0 m×0.32 mm，0.50 μm）；检测器温度：290 ℃；载气：高纯氮气，流量为30 mL/min；进样口温度：270 ℃；进样方式：分流进样，分流比为20∶1；色谱柱流量：2.00 mL/min，吹扫气：高纯氮气，流量为3.0 mL/min；柱温：程序升温，初始温度为60 ℃，再以5 ℃/min 速率升温至230 ℃，保持10 min。

1.3 溶液配制

丙三醇标准储备液：1 mg/mL，精确称取10 mg丙三醇标准品于10 mL 容量瓶中，加入无水乙醇定容。

丙三醇系列标准工作溶液：分别取丙三醇标准储备液0.25、0.50、0.75、1.25、2.50 mL，各加入到1只25 mL容量瓶中，用无水乙醇定容，混匀，过0.22 μm滤膜。所得系列标准工作溶液的质量浓度分别为10、20、30、40、50 μg/mL。

样品溶液：精确称取1 g 透明质酸凝胶样品于10 mL具塞玻璃管中，加入氢溴酸5 mL，混合均匀，于沸水中煮50 min，将溶液转移至烧杯中，用6 mol氢氧化钠溶液调节溶液至中性（pH 7.0～7.2）。将烧杯置于数显多头磁力恒温搅拌器上，于65 ℃以转速400～500 r/min 旋转蒸发，至烧杯中无液体，静置放凉；加入5 mL 无水乙醇，于超声器中超声30 min 后转移至离心管中离心20 min，用注射器吸取上清液，过0.22 μm滤膜。

1.4 实验步骤

使用气相色谱仪按照1.2 色谱条件检测丙三醇系列标准工作溶液，以溶液质量浓度为横坐标、色谱峰面积为纵坐标进行线性回归，建立丙三醇的标准曲线；同法检测样品溶液，利用色谱峰面积外标法计算出样品中丙三醇的质量浓度，将所得丙三醇浓度带入式(1)计算凝胶样品的修饰度Dm：

式中：V——无水乙醇总体积，mL;

ρ——样品溶液中丙三醇的质量浓度，mg/L；

ρHA——样品溶液中透明质酸钠的质量浓度，mg/mL；

mHA——样品溶液中透明质酸钠的质量，g。

2 结果与讨论

2.1 实验条件优化

2.1.1 酸解温度和酸解时间的选择

制备样品时，需通过酸解透明质酸凝胶样品得到丙三醇，而不同酸解温度会影响样品的酸解程度和速度，最终影响丙三醇的含量测定结果。分别采用常温酸解和沸水酸解两种方式处理样品，对比丙三醇色谱峰面积测定值，并确定最终酸解条件。经试验比较，称取同一批次且质量相同的凝胶样品进行酸解，分别在沸水酸解、常温消解条件下，酸解40、50、60 min，经测试后对比丙三醇色谱峰面积，结果见图1。由图1可知，沸水酸解样品丙三醇色谱峰面积远大于常温酸解丙三醇色谱峰面积，且沸水酸解时间到达50 min后，丙三醇色谱峰面积再无明显增加，说明沸水酸解条件下，凝胶能更快降解。综合考虑，最终选择沸水酸解，酸解时间为50 min。酸解方式的确定使得样品降解的更彻底，且大幅缩短制样的周期。

图1 不同酸解温度和酸解时间的丙三醇色谱峰面积

2.1.2 载气流量的选择

载气流量是气相检测中的重要参数，直接影响气相色谱峰的分离度、色谱柱理论塔板高度、柱效等指标。一般情况下，选择的载气流量范围在10～100 mL/min。当载气流量设置过低时，样品的扩散能力减弱，增加色谱柱的使用，从而影响色谱柱的柱效；当载气流量设置过高时，会影响样品在色谱柱内的保留，并且会影响色谱柱的柱效，间接影响检测结果。根据多次实验结果和实际色谱柱柱效表明，选择30 mL/min的载气流量为最适流量。

2.1.3 色谱柱升温速率的选择

采用程序升温方法进行丙三醇含量的测定，其中升温速率的快慢会对色谱峰有明显的影响。升温速率高会降低色谱峰的分离度，升温速率低又会增加检测时间，因此需要确定最佳升温速率。分别设置升温速率为5、25 ℃/min进行试验，结果见图2。

图2 不同升温速率的凝胶样品的气相图谱

由图2可知，在其它试验条件相同的情况下，当升温速率为5 ℃/min 时，丙三醇峰的分离度为2.998；当升温速率为25 ℃/min 时，丙三醇的分离度为0.109。分离度过低会导致被测物质中各组分分离不完全，因此选择升温速率为5 ℃/min。

2.2 方法专属性

精密量取丙三醇标准工作溶液、样品溶液、丙三醇加标凝胶样品溶液各1 mL，按照1.4步骤检测，色谱图见图3。由图3可知，三种溶液的保留时间均在同一位置，在目标峰出现的位置确属于待检测的丙三醇峰，证明该方法的专属性很高，检测过程中不会出现杂峰的干扰。

图3 丙三醇标准工作溶液、消解前后的凝胶溶液色谱图

2.3 方法精密度

配制6 份凝胶样品溶液，按1.4 方法进行检测，考察凝胶样品丙三醇含量和保留时间的相对标准偏差，试验结果列于表1。由表1 可知，样品中丙三醇含量测定结果的相对标准偏差为1.13%，保留时间的相对标准偏差为0.02%，表明该方法的重现性很好，具有很高的精密度，能够满足定量分析的要求。

表1 精密度试验结果

2.4 稳定性测定

取1份凝胶样品溶液，每隔3 h，按照1.4方法检测1 次样品，测定结果列于表2。由表2 可知，计算得丙三醇峰面积的相对标准偏差为0.77%，表明在15 h内，样品中丙三醇含量是稳定的。

表2 稳定性试验结果

2.5 线性关系和方法检出限

按1.4 方法检测丙三醇系列标准工作溶液计算线性方程和相关系数。结果表明，丙三醇质量浓度在8.16～122 μg/mL 范围内与色谱峰面积线性关系良好，线性方程为y=3 266.9x-8 404.7，线性相关系数r=0.999 7。

以3倍信噪比对应的丙三醇质量浓度确定检出限为0.037 μg/mL，以10 倍信噪比对应的丙三醇质量浓度确定定量限为0.83 μg/mL。

2.6 样品加标回收试验

称取已知组分含量的透明质酸凝胶样品溶液，用标准加入法分别测定40.13、36.48、32.83 μg/mL 3个添标水平下丙三醇的回收率，每组样品6份，结果见表3。由表3 数据可知，丙三醇平均回收率为99.17～99.94%，表明该方法的准确度很高，满足样品的分析要求。

表3 样品加标回收试验结果

3 结语

通过优化样品处理和检测条件，建立了测定交联透明质酸钠凝胶修饰度的气相色谱法，经方法学验证，所建立的方法具有重复性好、准确度高、检出限低等优点，证明该方法可高效、准确的检测透明质酸凝胶样品中的丙三醇含量，再通过计算即可得到凝胶样品的修饰度。