扁塑藤素通过调节自噬对口腔鳞状细胞癌细胞CAL-27 增殖的影响

杨诗媛 ，张 昊 ，胡图强

（1）湖北医药学院口腔医学院，湖北 十堰 442000;2）十堰市人民医院/湖北医药学院附属人民医院口腔医学研究所，湖北 十堰 442000）

口腔癌，主要为口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC），是第八大最常见的癌症类型，仅在2018 年就有17 万人死亡，新增病例超过35 万例[1-2]。OSCC 不仅复发率高、侵袭性强，还易对传统化疗药物产生耐药性[3]。目前手术切除为主，放射治疗和化学治疗联合为辅仍然是口腔鳞状细胞癌的首要治疗策略。尽管存在广泛的多种治疗模式，但是OSCC 5 a 总生存率仍然比较低，仅占50%～60%[4]。近几年来，免疫系统在OSCC 的发展、侵袭、进展和转移中起着重要作用[5]，因此需要一种新的治疗模式，例如免疫靶点以及天然化合物与常规化疗药联合使用等，以获得最佳治疗效果。综上所述，探索OSCC 发生的生物分子机制、找寻新的治疗关键、开发更有效治疗方案、提前预防OSCC 发生从而降低患者死亡率迫在眉睫。

自噬是介导各种细胞代谢物递送到溶酶体进行降解和回收的主要机制，能维持蛋白质稳态以及细胞器的完整性，其功能对于细胞稳态和细胞活力至关重要[6]。许多研究表明，自噬在不同的阶段调控者肿瘤的成长、发展，在癌症发展的早期阶段，它阻止肿瘤启动，但在完全发育的成熟肿瘤中，它则保护肿瘤细胞免受各种应激刺激[7-9]。在癌症发展的晚期阶段，由于癌细胞比正常细胞有更高的生物能量及营养需求，癌细胞通过诱导自噬在低营养和缺氧条件下存活[10]。自噬可以同时起到抑制肿瘤和促进肿瘤的作用，通常取决于肿瘤所处阶段和突变背景[6]。

近些年来，草药、天然化合物等作为单一疗法或与常规化疗药物联合使用，目前研究表明其在治疗各种癌症方面发挥着一定的作用。扁塑藤素是一种从雷公藤科和马齿苋科中提取的醌甲酰胺类三萜类化合物[11]，可抗氧、抗炎、抗菌[12]，在结肠癌、肺癌、乳腺癌、食管癌等许多癌症种类中展现了强大的抗癌活性[13-15]。肿瘤相关抑制机制包括细胞周期停滞、蛋白酶体活性诱导的细胞凋亡和线粒体功能障碍等[16]。对于扁塑藤素在OSCC 中的抗癌机制，现在国内外关于这个问题的研究相对较少。

本实验以口腔鳞状细胞OSCC 细胞系CAL-27 为研究对象，将OSCC 细胞用不同浓度梯度的扁塑藤素干预，通过CCK-8 细胞增殖、集落形成实验、蛋白质印迹法等一系列实验探究扁塑藤素对OSCC 细胞增殖与自噬机制的关系，并探索其生物分子作用机制，为其应用于临床提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人口腔鳞癌CAL-27 购自中国丰晖生物；扁塑藤素中国源叶生物；雷帕霉素购自中国MCE；高糖培养基、胰蛋白酶、胎牛血清FBS 购自美国Hyclone；酶标仪购自中国雷杜RT-6100；MAP1-LC3B、BECLI1、PCNA、蛋白印迹系统购自美国ChemiDocXRS+，BIO-RAD、SDS-PAGE 凝胶快速制备试剂盒购自中国Boster Bio；CCK-8 检测试剂盒、RIPA 蛋白裂解液（强）、PMSF（100 mM）、SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液（5×）、电化学发光液（ECL）购自中国上海碧云天生物。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养将人口腔鳞癌细胞系CAL-27（培养条件10%胎牛血清、10%FBS、1%双抗的高糖DMEM 培养基）置于37℃、95%空气、5%CO2细胞培养箱中，细胞长满皿底面积80%～90%需进行传代，第1 次传代比例为1∶2。

1.2.2 CCK-8 检测扁塑藤素对口腔鳞状细胞癌的增殖作用在96 孔细胞培养板中按8 000 个细胞/孔接种对数生长期的CAL-27 细胞，加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 µmol/L（后续浓度分组相同）浓度扁塑藤素的培养液，每组5 个平行重复。设置扁塑藤素作用于Cal-27 细胞时间为24、48、72 h，每个细胞培养孔中，培养基与CCK-8 溶液比例为9∶1 混合后培养，酶标仪测各组OD 值，分析处理数据，绘制增殖曲线。根据细胞增殖抑制率公式计算细胞增殖抑制率，得出扁塑藤素干预OSCC 细胞的半抑制浓度IC50，基于此设置合适的扁塑藤素浓度范畴。

1.2.3 扁塑藤素对增殖相关蛋白表达的影响在6 孔板中接种CAL-27，以上述浓度扁塑藤素处理24 h，细胞在RIPA 缓冲液中溶解，并加入蛋白酶抑制剂，在冰上溶解30 min，冰浴、离心、提取、测浓度、定量、煮沸、变性；转膜、封闭、孵育一抗（PCNA，1∶2 000），4℃过夜；孵育二抗（羊抗鼠，1∶5 000），内参蛋白β-actin。将ECL 显色试剂A 液与B 液1∶1 充分混合，均匀加于膜上，于凝胶成像系统中显影，ImageJ 软件完成数据分析。实验重复3 次。

1.2.4 细胞集落形成检测不同浓度扁塑藤素处理人鳞状细胞的增殖能力在6 孔板中按1 000 个/孔细胞接种状态良好的CAL-27 单细胞悬液，与扁塑藤素联合处理。按上述扁塑藤素浓度分组每3d 换一次液，待生长2 周后可见集落时终止培养，干燥固定、染色，倒置显微镜下记录细胞集落数目并拍照留存。

1.2.5 扁塑藤素处理Cal-27 后总蛋白的提取和Western Blot 检测相关自噬通量方法同“1.2.3”，一抗（MAP1LC3B，1∶500；BECLIN1，1∶5 000），二抗（羊抗兔：1∶5 000）。

1.2.6 CCK-8 法检测雷帕霉素（RAPA）以及RAPA联合扁塑藤素对Cal-27 细胞增殖抑制的影响为进一步研究自噬对扁塑藤素调节CAL-27 细胞增殖抑制的影响，本实验分别设置0、62.5、125、250、500、1 000 nmol/L RAPA 浓度培养液，方法同“1.2.2”，使雷帕霉素干预24 h，计算各组细胞增殖抑制率。根据细胞增殖抑制率，计算分析雷帕霉素作用于OSCC 细胞的最小浓度，并根据最小雷帕霉素浓度设置后续实验雷帕霉素的浓度。

1.2.7 细胞集落形成检测RAPA 联合扁塑藤素处理CAL-27 细胞后的增殖能力方法同“1.2.4”，分别设置0、0.6 µmol/L pristimerin、0.6 µmol/L Pri +125 nmol/L RAPA、125 nmol/L RAPA 组，检测细胞增殖能力。

1.2.8 RAPA 联合扁塑藤素处理CAL-27 细胞后总蛋白的提取和Western blot 检测相关自噬通量的表达情况方法同“1.2.3”，分组同“1.2.7”，加入一抗（MAP1LC3B，1∶500；BECLNI1，1∶5 000；PCNA，1∶2 000），二抗（羊抗兔，1∶5 000；羊抗鼠：1∶5 000）。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 扁塑藤素对人口腔鳞状细胞癌增殖活性的影响

2.1.1 不同浓度的扁塑藤素对人口腔鳞状细胞癌增殖活性的影响检测扁塑藤素对人口腔鳞状细胞癌系CAL-27 作用的结果，CCK-8 结果显示：扁塑藤素抑制CAL-27 细胞的增殖，并且这种抑制呈时间-浓度依赖作用，相同时间段内，当扁塑藤素浓度的升高，扁塑藤素对CAL-27 细胞系的抑制率也在不断增强，见图1A。且在同一浓度处理后，培养时间增加，CAL-27 细胞系的细胞抑制也更加显著（P<0.05），见图1B。根据结果计算得出CAL-27 的半抑制浓度约为（0.69±0.16）µmmol/L。根据半抑制浓度分设各组扁塑藤素浓度：0 µmol/L、0.2 µmol/L、0.4 µmol/L、0.6 µmol/L、0.8 µmol/L、1.0 µmol/L。

图1 扁塑藤素抑制口腔鳞状癌Cal-27 细胞增殖Fig.1 Pristimerin suppresses proliferation of oral squamous cell carcinoma cell

2.1.2 不同浓度的扁塑藤素对人口腔鳞状细胞癌增殖能力的影响通过集落形成实验检测不同浓度扁塑藤素处理CAL-27 细胞24 h 后培养14 d 增殖的长期毒性作用。结果显示：与对照组比较，CAL-27 各实验组的的细胞集落形成逐渐减少，并且抑制作用随着扁塑藤素浓度增加而受到增强，1.0 µmol/L 组的抑制作用更为明显，见图2。提示扁塑藤素对人口腔鳞癌CAL-27 细胞系的长期细胞抑制同上述结果相一致，存在剂量-时间关系。

图2 扁塑藤素对口腔鳞状癌CAL-27 细胞克隆形成的影响Fig.2 The effect of Pristimerin on clonal formation of oral squamous cell carcinoma cell

2.1.3 扁塑藤素对增殖相关蛋白表达的影响PCNA是增殖相关蛋白。为进一步说明扁塑藤素对细胞增殖的影响，本实验按2.1.1 分组的扁塑藤素分别处理CAL-27 细胞24 h，收取细胞蛋白后进行Western blot 实验。结果显示：当扁塑藤素浓度升高时，细胞增殖蛋白指标PCNA 蛋白相较于对照组表达量下调，但0.4 µmol/L 组蛋白表达量相较于0.2 µmol/L 组有所上调，提示扁塑藤素可以明显抑制CAL-27 细胞增殖（P<0.05），促使细胞活性下降，见图3。

图3 扁塑藤素抑制相关增殖指标PCNAFig.3 Effect of Pristimerin on PCNA expression

2.2 扁塑藤素诱导口腔鳞状细胞癌细胞发生自噬

运用Western blot 检测不同浓度扁塑藤素处理CAL-27 细胞24 h 后，自噬相关蛋白BECLIN1、LC3B-II、LC3B-I 的表达量。结果显示：实验组显示出，BECLIN1 蛋白的表达水平整体低于对照组，但0.4 µmol/L 组相较于对照组略有上升，LC3B-II/LC3B-I 蛋白的表达水平低于对照组，且随着扁塑藤素浓度的升高，BECLIN1 和LC3BII/LC3B-I 蛋白的表达水平下调（P<0.05），提示扁塑藤素通过抑制CAL-27 细胞的自噬来抑制细胞的增殖，见图4，说明CAL-27 的自噬可以被扁塑藤素激活，提示扁塑藤素抑制CAL-27 细胞的自噬。

图4 扁塑藤素抑制自噬相关自噬蛋白BECLIN1、LC3B-IILC3B-IFig.4 Pristimerin inhibits apoptosis：BECLIN1and LC3B-II/LC3B-I protein expression

2.3 自噬激活剂雷帕霉素可激活扁塑藤素诱导的自噬机制

2.3.1 扁塑藤素联合RAPA 对人口腔鳞状细胞癌CAL-27 增殖活性的影响为进一步研究自噬对扁塑藤素调节CAL-27 细胞增殖抑制的关系，通过CCK-8 法检测RAPA 各浓度组62.5、125、250、500、1 000 nmol/L 以及0.6 µmol/L 扁塑藤素联合RAPA 处理CAL-27 细胞24 h 后的OD 值。结果显示:不同浓度自噬激活剂RAPA 的细胞活力与对照组相比（未加入RAPA 组），RAPA 各分组的抑制率相较于空白组来说都呈出现了减低，提示RAPA 对CAL-27 细胞存在一定的影响，RAPA 可抑制CAL-27 细胞增殖，而且其抑制率随RAPA浓度上升稍有增加（P<0.001），见图5A。随后，通过细胞增殖实验检测0.6 µmol/L 扁塑藤素联合各浓度的自噬激活剂RAPA 处理CAL-27 细胞24 h 后的细胞活力，结果显示：与0.6 µmol/L 扁塑藤素组相比，62.5 nmol/L RAPA 联合0.6 µmol/L扁塑藤素组相比有统计学意义（P<0.05），见图5B，说明加入自噬激活剂RAPA 可明显提高细胞活力。细胞集落形成实验也与上述一致，见图6。提示RAPA 能够激活细胞自噬，从而减小扁塑藤素对细胞的抑制作用，本研究选择对CAL-27 细胞影响小的62.5 nmol/L RAPA 浓度进行后续实验。

图5 自噬激活剂RAPA 对口腔鳞状癌细胞的影响Fig.5 Effect of autophagy activator RAPA on oral squamous carcinoma cells

图6 扁塑藤素联合雷帕霉素处理对口腔鳞状癌CAL-27 细胞克隆形成的影响Fig.6 The effect of Pristimerin combined with RAPA on clonal formation of oral squamous carcinoma cells

2.3.2 扁塑藤素联合RAPA 处理CAL-27 细胞24h 后细胞自噬的作用WB 结果显示在CAL-27 细胞中，联合处理组均显示出BECLIN1 和LC3B 蛋白的表达水平高于对照组，扁塑藤素联合RAPA 组相较于单纯使用扁塑藤素组，BECLIN1 和LC3B 蛋白的表达水平均有上调（P<0.05），见图7。提示RAPA 激活了CAL-27 的自噬，扁塑藤素通过抑制CAL-27 细胞的自噬来抑制细胞的增殖。

图7 雷帕霉素可激活扁塑藤素诱导的自噬机制Fig.7 RAPA can activate the autophagy mechanism induced by Pristimerin

3 讨论

口腔鳞状细胞癌作为头颈部鳞状细胞癌中常见的类型之一，它起源于口腔黏膜上皮，由暴露于烟草致癌物、感染人乳头瘤病毒和饮酒过度诱发。目前包括局部及全身治疗，局部有手术、放射治疗；全身有靶向、生物、免疫治疗等。但其5 a 生存率较低，对于患者来说存在经济负担与面部畸形的双重风险。

抗癌研究热点之一的中草药在医学领域以及人类健康保健中持续发挥着重大作用。有较多研究表明扁塑藤素可对多种恶性肿瘤发挥发病、进展发挥抑制作用。扁塑藤素对乳腺癌细胞周期有抑制作用并且能引发细胞凋亡和自噬，可降低乳腺癌细胞在体外和异种移植物在体内的生长[18]；肺癌易发生化疗耐药，当顺铂联合扁塑藤素时，其可增强肺癌细胞敏感性[19]；扁塑藤素可能通过调控 MEK/ERK 信号通路相关蛋白的磷酸化水平抑制膀胱癌细胞增殖并诱导细胞凋亡[20]。因此，探讨扁塑藤素对人口腔鳞状细胞癌增殖潜力的影响及相关作用机制，是本研究的重点。本课题组研究发现扁塑藤素抑制口腔鳞癌细胞CAL-27 增殖，CCK-8 结果分析扁塑藤素与CAL-27 细胞呈时间-浓度依赖关系，细胞集落形成实验结果也与上述一致。

迄今为止，有研究指出自噬参与了以下几种疾病，包括肌病、神经退行性疾病、传染病、自身免疫性疾病、心脏病、细胞死亡、衰老和癌症[21]。其中，自噬蛋白水平在调节肿瘤细胞生长和进展方面起着重要作用[22]。LC3 属于ATG8 家族，通过ATG3B 转化为其胞质亚型LC1，再与磷脂酰乙醇胺（PE）结合，转化为膜结合形式LC3 II[23]，故LC3 蛋白可以直接监测自噬活性[24]；VPS34 及其结合物Beclin1 和VPS15 可靶向调节自噬，可促进自噬小体形成[25]，因此LC3 与Beclin1 蛋白都是自噬相关特异性指标。为了探寻扁塑藤素对OSCC 中Cal-27 细胞自噬机制的关系，本实验运用扁塑藤素分别在调控相关自噬通量，激活自噬对扁塑藤素调控OSCC 中CAL-27 细胞发生增殖抑制作用以及对相关自噬通量的影响等3 个方面进行检测，结果显示，扁塑藤素可显著减少CAL-27 的LC3-Ⅱ等自噬相关蛋白的表达量。这提示扁塑藤素调节CAL-27 细胞自噬是其抑制OSCC 增殖的关键机制之一。

目前各种合成的自噬调节剂，如丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的哺乳动物靶点雷帕霉素（mTOR），已被确定为治疗癌症的首选药物，包含mTORC1、mTORC2 两种复合物，而mTORC1 被雷帕霉素（RAPA）抑制后从而启动自噬，是自噬的强诱导剂[26]。本文检测了相关自噬通量BECLIN1、LC3B-II/LC3B-I 表达量，发现扁塑藤素联合RAPA 相较于仅用扁塑藤素处理CAL-27 细胞其表达量有所上调，表明RAPA 可以逆转扁塑藤素对CAL-27 细胞的增殖抑制，即激活CAL-27 自噬，且自噬流通畅。最后检测了增殖指标PCNA，这与上述结果也是一致的。进而证明，扁塑藤素通过抑制OSCC 自噬导致细胞增殖活性减弱。

综上所述，扁塑藤素可以抑制CAL-27 细胞的增殖，且随着扁塑藤素浓度的升高，抑制作用越明显，这可能与其下调自噬相关基因BECLIN1、LC3B-II、LC3B-I 的表达相关。本研究初步探讨了扁塑藤素对口腔鳞状细胞癌细胞的抑制作用及其自噬机制，这可能是一种潜在的抗癌策略，但本实验细胞系单一、缺乏动物实验佐证，还需大量的自噬检测技术支持验证。